鹅星状病毒RT-PCR 检测方法的建立

李 阳，刘英姿，李阁锦，曹祁峰，王家英，舒秀伟，周铁忠，高慎阳*

（1. 锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州121000；2. 辽宁益康生物股份有限公司，辽宁辽阳111000）

星状病毒（astroviruses，AstV）为单股正链、无囊膜的RNA病毒，根据感染宿主的不同将其划分为两个不同的病毒属，即哺乳动物星状病毒和禽星状病毒[1]。禽星状病毒基因组全长6.9～7.9 Kb[2]。基因组包括5'UTR ORF1a、ORF1b 和ORF23 个开放阅读框及3'UTP、多聚腺苷酸（PolyA）尾[3]。

2016年初，我国山东、江苏、河北、江西、广东、安徽、河南等省鹅场陆续发生雏鹅高致死性痛风病，严重威胁我国养鹅业的发展。鹅痛风病主要侵害15日龄以内的雏鹅，各品种的鹅均易感，发病高峰在10日龄前后，临床上可致雏鹅生长发育受阻、精神沉郁、采食量减少、关节肿大，甚至死亡。死亡率可达30%～40%，饲养管理条件差的最高可达50%左右，尸检可见全身各脏器的严重尿酸盐沉积，尤以心、肝和肾较为严重[4-6]。研究表明，鹅星状病毒是该次疫病的主要病原体[4]。目前，该病尚无商用化特效药以及疫苗。防治该病的方法主要为降低饲料的蛋白质含量、钙磷比例及抗菌抗毒的治疗。该病的传播速度快、致死率高。因此，该病的防治在于对疾病的监测和控制，建立一种快速、准确、廉价的检测方法对该病的防控尤为重要。

RT-PCR 检测方法具有检测快速、操作简便、特异性强和敏感度高等特点。本研究根据Genbank 中GAstV 的ORF1b 保守序列，设计1 对特异性引物，建立GAstV 的RT-PCR检测方法，为GAstV的快速诊断和流行病学的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

试验检测用病料来自辽宁省营口市某鹅场，为因雏鹅痛风而发病死亡的雏鹅心脏、肝脏、肾脏等组织。样品采用Chu 等[7]的方法检测为GastV 阳性后由本实验室保存。

1.2 试验试剂

病毒基因组DNA、RNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒、DH5α 感受态细胞、琼脂糖、DNA 胶回收试剂盒购自TIANGEN；pMD18-T 载 体、DL2000 DNAmarker 购 自TaKaRa；反转录试剂盒购自成都福际生物技术有限公司；2×ES Taq MasterMix、ddH2O购自北京康为世纪生物科技有限公司；鸡病毒性关节炎活疫苗（ZJS 株）购自广东温氏大华农生物有限公司；鹅细小病毒小鹅瘟二联活疫苗（P1株+D株）、鸭呼肠孤病毒活疫苗（CA株）、坦布苏病毒活疫苗（FX2010-180P株）购自易邦生物工程有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank 登录的GAstV 病毒株（MN428642.1）ORF1b阅读框碱基序列，利用Oligo 7.0软件设计1对特异性引物GAstVF/R，预期扩增片段为329 bp，PCR 特异性引物见表1，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 PCR特异性引物Tab.1 The specific primers of PCR

1.4 重组质粒标准品的制备

对本实验室保存的阳性GAstV病料进行RNA提取以及反转录，以获得的cDNA为模板与特异性引物GAstVF/R进行PCR 扩增，产物经凝胶琼脂糖电泳鉴定后，按照司广斌等[8]的方法将目的片段进行回收、纯化、克隆。构建pMD18-T-GAstV 重组质粒。通过Thermo nanodrop one测定质粒浓度，按照拷贝计算公式（质粒浓度ng/L×6.02×1023）/（109×基因组长bp×660），计算重组质粒拷贝数。

1.5 RT-PCR方法的建立

PCR反应体系为30 μL，见表2。

表2 PCR反应体系Tab.2 The reaction system of PCR

PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。

1.6 特异性试验

以提取的GPV、DRV、AVAV、TMUV 的cDNA 为模板，同时设置阴性对照（ddH2O）及阳性对照（GAstV），验证该方法的特异性。

1.7 敏感型试验

将质粒原液进行10-2～10-8倍稀释后分别作为模板，确定该方法的敏感性。将质粒浓度换算成拷贝数，测得最底检出限。

1.8 重复性试验

选取3个不同批次的阳性样品，每个样品3个重复，进行3次重复测定，验证该方法的可靠性。

1.9 模拟临床样品检测

构建10 份人工模拟病料进行检测限LOD 分析，样品依次加入十倍系列（10-1～10-10）浓度稀释的阳性质粒，使用RNA、DNA 提取试剂盒进行提取，利用本试验建立的RTPCR 方法进行检测，以实验室保存的GAstV 作为阳性对照。PCR产物以1.5%琼脂凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 重组质粒标准品的鉴定（见图1）

以重组质粒pMD18-T-GAstV 为模板，进行PCR 扩增。由图1 可知，质粒与阳性对照目的片段一致，表明pMD18-T-GAstV重组质粒构建正确。

图1 重组质粒标准品鉴定结果Fig.1 The results of recombinant plasmid reference

2.2 特异性试验结果（见图2）

用本研究建立的RT-PCR 方法分别对几种临床常见禽病病原（GPV、DRV、AVAV、TMUV）进行特异性检测。由图2 可知，仅GAstV 出现特异性扩增条带，其他病原及阴性对照均未出现任何条带。表明该方法具有良好的特异性。

图2 引物特异性试验结果Fig.2 The results of specificity detection of the primers

2.3 敏感性试验结果（见图3）

图3 RT-PCR方法的敏感性试验结果Fig.3 The results of conformity test of RT-PCR

将质粒原液进行10-2～10-8倍稀释后分别作为模板，利用本研究建立的RT-PCR 方法进行检测。由图3 可知，通过Thermo nanodrop one 测定重组质粒浓度为43.7 ng/μL，根据公式换算成拷贝数1.21×1010copies/μL。测得该方法最低检测限可达1.21×103copies/μL。

2.4 重复性试验结果（见图4）

选取3 个不同批次阳性样品，每个样品进行3 次重复性检验。由图4可知，扩增产物亮度、位置无明显差异，表明该方法重复性很稳定。

图4 RT-PCR重复性试验结果Fig.4 The results of repeatability test of RT-PCR

2.5 模拟临床样品检测结果（见图5）

将10 份人工模拟样品进行DNA 提取后，用本研究建立的RT-PCR 方法进行检测。由图5 可知，最低检出限LOD为1.21×103copies/μL。

图5 模拟临床样品检测结果Fig.5 The results of artificial samples panels

3 讨论

2016年，全国爆发高致死雏鹅痛风病，给我国养鹅业带来严重的影响。禽痛风是由于尿酸产生过多或排泄障碍，引起的大量尿酸盐堆积在皮下、组织、关节的一种营养代谢性疾病[9]。研究表明，鹅痛风病主要是饲喂过量高蛋白、高钙饲料引起的[10]。有学者在患病鹅体内分离出星状病毒，确定了真正病因[11]。由于鹅痛风病的2 种致病因素症状类似，凭借临床症状和病理变化很难进行区分，给现场检疫带来困难，所以需要检测人员进行实验室诊断。基于TaqMan探针法检测GAstVd的qRT-PCR方法已经建立和应用[12]，该方法特异性强，但受限于探针的合成以及qPCR仪器过于昂贵、操作复杂，不适用于基层常规实验室检测。张玉霞等[13]建立了环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法对GAstV进行检测，该方法能在恒温条件下快速扩增核酸，但是受限于试剂盒和酶的价格，加大检测成本，不适用于大量临床样品检测。为控制GAstV 疫情的流行和减少养鹅产业的损失，需要设计一种省时、可以大量检测、廉价、操作简单，且适用于常规实验室以及基层检测部门的方法。在实验室检测中，RT-PCR 是最常用的检测方法，通过对核酸进行检测确定病毒的感染。该方法一直应用于多种动植物病毒的检测[14-16]。该方法简便、易操作、检测迅速、价格低廉，可用于大量临床样品的检测，适用于基层常规实验室进行检测。

本研究比对GAstV ORF1b 基因保守区域设计出一对特异性引物，建立一种用来检测GAstV 的RT-PCR 方法。通过对其他几种常见禽病进行特异性检测，结果显示，扩增出单一特异性条带与预期目的片段大小一致，确定该方法有良好的特异性。经敏感性试验结果显示，本研究建立的方法LOD 可达1.21×103copies/μL，确定该方法有良好的敏感性。本研究中，重复性试验的条带大小、亮度均一致，确定该方法有良好的重复性；模拟临床样品检测试验中，最低检出限为1.21×103copies/μL。

4 结论

本研究建立的RT-PCR 方法特异性强、敏感的高、重复性好、成本低廉、操作简单、可进行大量检测，适用于实验室对GAstV的病因进行快速检测，为基层检测部门对疫情进行监测提供有效手段，同时为后续建立一种恒温、快速检测方法提供参考。