菊苣多糖对小鼠药物性肝损伤保护作用的筛选

王晓杰，吾买尔江·牙合甫，*，阿丽米热·买买提，韩俊成，杨 莉，夏利宁，赛福丁·阿不拉，卡哈尔·司马义

（1. 新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052；2. 哈密市伊州区花园乡卫生院，新疆哈密839000）

菊苣（Cichorium intybusL.）属于菊科菊苣族菊苣属的多年生植物。菊苣中的化学成分主要含三萜、倍半萜、香豆素、花色素类等有效活性物质[1]。菊苣可入药，具有清热解毒、消炎利尿、清肝利胆等疗效[2]。菊苣主治肝炎、肝衰竭、肝硬化、肾炎、肠炎等疾病[3]。多糖是一种大分子生物活性物质，菊苣多糖具有抗疲劳、抗氧化、降血脂、降血糖、抗癌、抗肿瘤等作用。多糖作为菊苣的有效成分之一，其多糖含量也颇高[4-6]。菊苣多糖保肝作用方面的研究已具备众多数据支持，但没有发挥菊苣多糖的最大药用价值，导致资源的潜在浪费[7]。

对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）是一种广泛使用解热镇痛药物。临床上普遍用于人、动物机体发热、缓解轻中度疼痛病例。APAP过量使用或不当使用会造成严重的不良反应。24 h内剂量超过4 g，会引起肝毒性反应；使用剂量超过10～15 g 可迅速引起急性肝衰竭，严重者死亡。我国APAP 中毒的发生在近二十年呈上升趋势，对人民的健康造成潜在威胁[8-11]。对乙酰氨基酚也是兽医广泛使用的解热镇痛药物之一，包括家畜、家禽各种发热疾病，如常见的呼吸道、消化道、生殖系统等细菌、病毒的感染引起体温升高的现象。但由于部分兽医用药不规范，超过安全剂量或滥用乙酰氨基酚引发的中毒案例更为常见[10,12-13]。本试验以APAP 诱导的肝损伤小鼠为模型，提取菊苣种子、根、茎及叶子4个部位多糖筛选清除自由基的能力，检测MDA 含量、SOD、GSH、H2O2酶活及HE 染色来评价菊苣多糖对肝脏保护作用，并探讨作用机理，进一步研究开发菊苣多糖的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菊苣根、茎、叶及种子均购自新疆哈密阿萨尔生物科技有限公司，经哈密市伊州区花园乡卫生院卡哈尔·司马义鉴定为菊苣。

1.2 试剂与仪器

谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（H2O2酶）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及Bicinchninic Acid（BCA）蛋白试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）及标准品N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）购自上海源叶生物科技有限公司。

UV1900 紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、HTX 多功能微孔板检测仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.3 菊苣多糖的提取

参照文献提取菊苣种子、根、茎及叶子多糖；近红外色谱发检测样品，使用苯酚-硫酸显色法测定菊苣水提物中总多糖含量，紫外分光光度计在490 nm 处测定吸光值[2]。

1.4 DPPH清除试验

准确称取0.0079 g DPPH于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至100 mL，即浓度为0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。将菊苣多糖溶液、NAC 溶液配制成不同浓度梯度的待测样品液，使用GraphPad软件计算IC50值，具体步骤参考文献记录[2]。

1.5 试验设计

模型建立及动物分组和处理：昆明系小鼠，雄性、体重（18±25）g，购自新疆医科大学实验动物中心。试验前适应性饲养1 周，自由进食和饮水。小鼠随机分为7 组，每组12 只小鼠，正常对照组（NC），模型组（APAP，300 mg/kg），菊苣多糖高剂量组（H+APAP，600 mg/kg），菊苣多糖中剂量组（M+APAP，300 mg/kg），菊苣多糖低剂 量 组（L+APAP，150 mg/kg），水 飞 蓟 宾 阳 性 组（APAP+S，300 mg/kg） ，菊 苣 多 糖 单 独 组（H，600 mg/kg），正常对照组灌胃等体积蒸馏水，连续3 d。末次给药1 h 后，正常对照组（NC）和菊苣多糖单独组（H）外，其他组建立急性肝损伤模型，腹腔按剂量300 mg/kg 注射APAP[2]。24 h 后处死小鼠，采集血液、肝组织。各组小鼠禁食，自由饮水。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 血清生化

给予APAP 24 h 后，采集血液。血液室温静置2 h，3000 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃保存。按照试剂盒操作方法测定ALT与AST活性。

1.6.2 肝脏生化

称取肝组织0.2 g，用组织匀浆机冰浴匀浆，2000 r/min，4 ℃离心15 min，上清液-20 ℃保存。按照试剂盒操作方法测定MDA 含量、SOD、GSH、H2O2酶活性和蛋白质的含量。

1.6.3 病理组织切片观察

取中性福尔马林溶液固定组织，脱水、石蜡包埋、切片和苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察肝组织的形态结构。

1.7 数据统计与分析

数据差异显著性通过SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，t检验比较各组间的差异，数值以“平均值±标准差”表示。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菊苣多糖含量测定（见图1）

以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到回归方程Y=14.47X-0.0159，（R2=0.9990）。

由图1可知，其浓度在10～50 mg/L的范围内与峰面积具有优良的线性关系。菊苣种子部位总多糖在四者之中含量最高为39%，其次茎（34%）、叶（29%）、根（28%）。

图1 菊苣总多糖标准曲线Fig.1 Standard curve of Cichorium intybus L.total polysaccharides

2.2 菊苣四种不同部位所提取多糖的红外光谱结果（见图2）

图2 菊苣多糖红外光谱图Fig.2 IR spectum of Cichorium intybus L.polysaccharide

由图2 可知，在400～4000 cm-1范围内显出典型的多糖吸收峰。3379～3383 cm-1处为O—H 的伸缩振动[9]；1606～1616 cm-1内 的 吸 收 峰 是C=O 伸 缩 振 动 峰[10]；2930 cm-1左右的吸收峰为C—H 伸缩振动吸收峰；在1000～1200 cm-1内的3个弱吸收峰表示吡喃型糖环。

2.3 菊苣多糖对DPPH自由基的清除效果（见图3）

图3 菊苣4个部位多糖对DPPH的清除效果Fig.3 DPPH radical scavenging activity of Cichorium intybus L.polysaccharide

由图3可知，随着浓度的升高，菊苣多糖清除DPPH自由基的能力逐渐增强。当浓度为1 g/L 时，菊苣种子、叶、根、茎多糖对DPPH 自由基的最大清除率达70%、64%、48%、62%，相应的IC50值分别为0.2094、0.3713、0.3966、0.3902 mg/mL。其中，种子部位所提取的多糖对DPPH自由基的清除率最强。

2.4 菊苣种子多糖对肝功能的影响（见图4）

图4 菊苣种子多糖对肝功能的影响Fig.4 Effect of chicory seed polysaccharide on liver function

由图4可知，APAP组的ALT、AST活性与NC组相比，差异极显著（P<0.01），H 组与APAP 组相比差异极显著（P<0.01），提示模型建立有效。其中，单项分析ALT 结果显示，APAP+H 组、APAP+M 组、APAP+L 组与APAP 组相比差异极显著（P<0.01）。APAP+H 组、APAP+M 组的AST活性与APAP 组相比差异极显著（P<0.01），APAP+L 组与APAP 组相比差异显著（P<0.05）。以上结果提示，菊苣多糖对APAP药物性肝损伤具有潜在保护能力。

2.5 菊苣种子多糖对过氧化产物的影响（见图5）

图5 菊苣种子多糖对氧化反应产物的影响Fig.5 Effect of chicory seed polysaccharides on oxidation reaction products

由图5 可知，APAP+H 组、APAP+M 组的肝组织谷胱甘肽活性与APAP 组差异极显著（P<0.01），APAP+L 组与APAP组差异显著（P<0.05）；APAP+H组、APAP+M组的超氧化物歧化酶活性与APAP 组差异显著（P<0.05）；APAP+H组、APAP+M组、APAP+L组的丙二醛含量与APAP组差异极显著（P<0.01）；APAP+H 组、APAP+M 组、APAP+L 组的过氧化氢酶活性与APAP组差异极显著（P<0.01）。安全剂量内菊苣多糖可降低APAP引起的MDA和H2O2酶水平的损伤性升高，可改善APAP 引起的对GSH 和SOD 的消耗，从而起到一定程度的肝脏保护作用。

2.6 各组肝脏病理切片结果（见图6）

图6 各组肝脏病理切片结果（×400）Fig.6 The results of hepatic pathology in each group（×400）

由图6 可知，在400 倍光镜下观察，NC 组和H 组中央静脉为轴心呈放射状排列，细胞排列紧密，无明显差别。APAP 组发现中央静脉周围炎性细胞浸润并存在出血，胞质间空隙增大，伴随大量空泡样结构的出现，表明APAP过量导致肝组织发生明显的病理变化；APAP+M 组、APAP+H 组与APAP 组比较肝损伤明显减轻，多糖治疗组可显著减缓APAP对肝细胞的损害；APAP+LAPAP治疗组中可见中央静脉周围炎性细胞的局部浸润及管腔壁的增厚。因此，菊苣多糖能恢复APAP引起的肝细胞破裂、肝组织毒性病理变化，证实具有明显的保护作用。

3 讨论

药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是药物代谢引起肝毒性或肝脏对药物及代谢产物的变态反应所产生的消化道系统疾病。目前，DILI病例上升速度及严重的危害性引起药物研究者的重视。由于服用药物者肝脏代谢功能降低、肾功能减退，导致机体未及时代谢产生毒性反应。兽药则对病畜产生DILI现象更为明显，加速病畜死亡。因此，如何减缓、治愈甚至预防DILI 无疑是一个迫在眉睫的课题。对乙酰氨基酚是人、兽医临床常用的解热镇痛药物[14-15]。该药物在治疗剂量阈值范围内具有良好的安全性，但摄入过量可能会产生严重的肝毒性作用，甚至导致危及生命的急性肝衰竭（ALF）。肝脏是机体内代谢药物的场所，药物进入体内后于肝脏处进行代谢，用药过量或用药不当都会使肝脏超负荷工作而引起损伤，药物代谢后产生的代谢毒性产物甚至会导致肝脏的急性衰竭。如过量使用APAP 即会导致剂量依赖性肝损伤，APAP 进入机体后，大部分药物在肝脏进行代谢，包括两种代谢途径，即硫酸化和葡萄糖醛酸化偶联反应及氧化成反应中间体N-乙酰对苯醌亚胺（N-acetyi-p-benzoquinone imine，NAPQI），后者与GSH 反应形成无毒代谢物。其中约65%的药物参与葡糖醛酸化反应，约30%的药物参与硫酸化反应，随后产生无毒结合物随尿液排出体外[16-17]；剩余约5%的药物在细胞色素酶的作用下产生有毒性的中间产物NAPQI，这种APAP毒性代谢反应主要是由细胞色素P450家族2E1（CYP2E1）催化[18]。GSH 与之结合可产生无毒产物，从而缓解APAP 的毒性作用，但摄取超治疗剂量的APAP会导致NAPQI的过量产生、细胞内谷胱甘肽的消耗以及NAPQI与细胞和线粒体蛋白的共价结合，从而导致核DNA损伤。线粒体的损伤使组织产生过氧化反应，过氧化产物MDA和H2O2酶的水平随着线粒体的损伤程度增加而升高，SOD 作为一种抗氧化酶，则随着损伤的增加而被消耗[19-21]。本试验测定GSH、MDA、H2O2酶含量统计显示高、中、低剂量组与模型组均表现出一定的差异性，含量统计显示高、中剂量组与模型组差异显著。可推测安全剂量内菊苣多糖可降低APAP引起的MDA和H2O2酶水平的损伤性升高，可改善APAP 引起的对GSH 和SOD 的消耗，从而起到一定程度的肝脏保护作用。这与上述文献报道的研究结果一致。ALT和AST是肝脏的代表性转氨酶，肝细胞受损时，转氨酶释放到血液中，使血清谷丙、谷草转氨酶活性升高。据报道，对啮齿动物采用APAP 过量诱导的模型普遍被认为是一种探索新的治疗策略的活体动物体内实验体系，包括对天然产物的测试[22]。菊苣多糖能有效防止肝脏细胞膜的破裂，降低APAP引起的ALT和AST的损伤性升高。本研究选取药用植物菊苣，建立小鼠DILI模型探究菊苣的肝保护作用，为进一步挖掘菊苣药用价值奠定基础，为深入研究菊苣提供前期依据。

4 结论

菊苣种子、叶、根、茎多糖含量依次为39%、34%、29%、28%，自由基清楚率依次为70%、64%、48%、62%，其中种子多糖对DPPH自由基的清除率最强。菊苣多糖对APAP引起的药物性肝损伤具有明显的修复和缓解氧化应激反应，其高剂量多糖则更能发挥其作用，缓解APAP 造成的氧化产物水平的升高和肝组织病理变化。