桉树轮斑病原菌生物学特性分析

廖旺姣，邹东霞，罗 辑，钟雅婷，吴耀军，黄乃秀，黄华艳

（广西壮族自治区林业科学研究院 广西优良用材林资源培育重点实验室广西林业有害生物天敌繁育工程技术研究中心，广西南宁 530002）

桉树（Eucalyptusspp.）是世界速生丰产造林树种之一，具有生长快、伐期短、产量高、用途广和效益好等优点，已成为我国南方重要的用材林树种和优良的绿化树种。广西桉树人工林发展迅速，从2000年的近15 万hm2发展到2013年最高峰的200 多万hm2。由于经营管理不当，且纯林面积不断扩大，桉树有害生物种类不断增多，危害面积增加，灾害日趋严重[1-4]。轮斑病是目前危害桉树叶片的重要病害，可引起叶片大面积枯死，严重时，整株桉树80%叶片出现干枯，林地发病率可达100%，严重影响桉树的生长和木材蓄积[5]。关于轮斑病的研究，目前主要集中在病原方面，黄翠流等[6]确定Pili⁃diella eucalyptorum和P.diplodiella为广西桉树轮斑病原菌，其中P.eucalyptorum主要危害桉树幼林及成林叶片，P.diplodiella主要危害苗期叶片。关于病原菌基本生物学特性尚未见报道。本研究分析P.eucalyptorum在不同营养和理化环境条件下的培养特性，旨在为桉树轮斑病发病规律和防治技术研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

本试验供试菌株为P.eucalyptorum，由广西壮族自治区林业科学研究院森林保护研究所提供。

1.2 生物学特性研究

1.2.1 病原菌培养

将供试菌株从4 ℃冰箱取出，挑取菌丝接种在PDA 平板培养基（马铃薯200.00 g、葡萄糖20.00 g、琼脂粉18.00 g 和水1 000 mL）中央[6]，置于25 ℃恒温箱暗培养6天，待菌落生长至近培养皿边缘，用灭菌打孔器（内径为6 mm）在菌落边缘打取菌块，备用。

从桉树林地采集产孢的典型轮斑病病叶，用流动自来水冲洗干净，75%酒精消毒表面，无菌水冲洗3次，然后用解剖刀刮下分生孢子，放入灭菌培养皿中，使用PDB 培养液（马铃薯200.00 g、葡萄糖20.00 g 和水1 000 mL）梯度配置分生孢子液，浓度为2.00×106个孢子/mL，备用。

1.2.2 温度对菌丝生长的影响

设置5、10、15、20、25、28、30、35 和40 ℃九个温度梯度，将菌块接种至PDA 平板中央，分别放置于上述9 种温度的恒温箱中进行恒温暗培养，培养5天后用十字交叉法测量菌落直径，每个温度处理6个重复。

1.2.3 pH对菌丝生长的影响

制备PDB培养液，pH设置为2 ～12，间隔为1，用1 mol/L的HCl和NaOH调配，接种3块菌块至上述培养液中，不同pH 值培养液设置3个重复。培养条件为120 r/min、28 ℃。震荡培养10天后，用100目纱网过滤收集菌丝，80 ℃烘干至恒重后称量菌丝干重[7]。

1.2.4 光照对菌丝生长的影响

参考赖传雅等[8]的试验方法并略作修改，在PDA 平板中央接种直径6 mm 的菌块，待菌落生长到直径30 ～40 mm后，分别置于全程暗处理、12 h光暗交替（40 W，灯皿距离20 cm，下同）、6 h/18 h 光暗交替（40 W）、全程光照（40 W）、紫外光12 h 光暗交替（20 W）、紫外光6 h/18 h 光暗交替（20 W）和全程自然光7 种光照条件，25 ℃恒温培养，培养6 天后测量菌落直径，测量方法同1.2.2。

1.2.5 不同碳、氮源对菌丝生长的影响

基础培养基为Czapek 培养基[7]，以等质量的乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-麦芽糖、可溶性淀粉、阿拉伯树胶粉、甘露醇、D-山梨醇置换其中的蔗糖，配置不同碳源培养基；以等质量的蛋白胨、酵粉、牛肉膏、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵、尿素、甘氨酸、DL-甲硫氨酸、DL-天门冬酰胺氮置换其中的硝酸钠，配置不同氮源培养基。平板中央接种6 mm 菌块，置于25 ℃恒温箱中暗培养，每种碳、氮源为1 个处理，每处理6 个重复，培养6 天后测量菌落直径，测定方法同1.2.2。

1.2.6 温、湿度对分生孢子萌发的影响

用移液器吸取适量的分生孢子液至凹面玻片，放入灭菌培养皿中，用保鲜袋包扎好，置于1.2.2 设置的温度梯度恒温箱中培养，96 h 后在40×10 倍显微镜下镜检，观察并记录分生孢子萌发数量，随机记录100个分生孢子中萌发孢子数，每个温度处理6个重复。

用移液器吸取适量的孢子液均匀涂抹于灭菌载玻片上，快速阴干后，分别放入相对湿度为100%+水滴、100%、90%、85%、75%、65%和50%的七个小容器中[7]，不同处理重复3次。25 ℃保湿培养96 h后镜检其孢子萌发数[9]

1.2.7 菌丝体和分生孢子致死温度测定

参考江正君等[10]试验方法并略作修改，分别挑取培养6 天的菌丝和刮取病斑上的分生孢子，用无菌水制成悬浮液，分生孢子浓度为2.00 × 106个孢子/mL，分别用移液器吸取4 mL 至灭菌的试管（15.0 mm × 150.0 mm）中，置于40 ～60 ℃（梯度为2 ℃）恒温水浴中处理10 min，迅速冷却，然后用移液器分别吸取0.2 mL 菌丝体悬浮液和分生孢子液放入PDA 平板培养基上，用灭菌三角玻棒均匀涂布，每处理3 个重复，25 ℃培养6 天后检查菌丝生长和分生孢子萌发情况。

2 结果与分析

2.1 不同温度对菌丝生长的影响

不同温度处理的菌落直径差异显著（P＜0.05），菌丝在10 ～35 ℃均能生长，低于10 ℃或高于35 ℃均不利于病原菌菌丝生长（表1）。28 ℃时菌丝生长最快，菌落直径为83.58 mm，是菌丝最合适的生长温度；其次是25 ℃，菌落直径为73.38 mm。温度高于28 ℃时，菌丝生长急剧下降，30 ℃的菌落直径为32.35 mm，较28 ℃菌落直径小51.23 mm，说明高温不利于菌丝生长。

表1 不同温度对桉树轮斑病原菌菌丝生长的影响Tab.1 Effects of different temperatures on mycelial growth of P.eucalyptorum

2.2 不同pH值对菌丝生长的影响

不同pH 处理的菌丝干重差异显著（P＜0.05）（表2）。菌丝在pH 2 ～12 环境下均能生长，pH 为6时菌丝干重最重，说明该菌在弱酸性的条件下生长最好，其次是pH 5和7。菌丝在强碱条件下（pH 10、11 和12）生长较差，在强酸性条件下（pH 2 和3）生长也较差。说明强酸或强碱不利于菌丝生长。

表2 不同pH处理对桉树轮斑病原菌菌丝生长的影响Tab.2 Effects of different pH values on mycelial growth of P.eucalyptorum

2.3 不同光照条件对菌丝生长的影响

菌丝在6 h/18 h 紫外光光暗交替处理下生长速度最快，菌落直径为82.03 mm，其次为12 h 光暗交替处理，菌落直径为78.29 mm，与其他处理差异显著（P＜0.05）；全光照、6 h/18 h 光暗交替和自然光照处理的菌落直径分别为71.78、67.19和63.21 mm；全黑暗处理的菌丝生长速度最慢，菌落直径为36.15 mm（表3）。

表3 不同光照条件对桉树轮斑病原菌菌丝生长的影响Tab.3 Effects of different light conditions on mycelial growth of P.eucalyptorum

该菌在紫外光光暗交替处理下，6 h/18 h光暗交替处理菌丝生长比12 h 光暗交替处理要快，说明短时间紫外光处理有利于菌丝生长，长时间处理则不利于菌丝生长。日光灯处理时，6 h/18 h光暗交替处理下的菌落直径比12 h 光暗交替处理要小；12 h 光暗交替和全光照处理相比，菌丝生长较快，说明适度的日光灯处理有利于菌丝生长。

2.4 不同碳、氮源对菌丝生长的影响

菌丝在不同碳源条件下均能生长，在乳糖和蔗糖培养基中生长快，菌落直径分别为76.88 和76.85 mm，与山梨醇处理外的其他处理差异显著（P＜0.05），说明这两种碳源适合菌丝生长；其次为D-山梨醇和D-葡萄糖，菌落直径分别为74.62 和73.95 mm；在阿拉伯树胶粉培养基上生长最慢，菌落直径为55.22 mm，说明阿拉伯树胶粉不适合菌丝生长（表4）。

表4 不同碳、氮源对桉树轮斑病原菌菌丝生长的影响Tab.4 Effects of different carbon sources and nitrogen sources on mycelial growth of P.eucalyptorum

菌丝在蛋白胨和酵母粉培养基上生长快，菌落直径分别为81.59和79.48 mm，与其他氮源处理差异显著（P＜0.05）；其次为硝酸钠培养基，菌落直径为59.64 mm；在尿素培养基上菌丝生长最差，直径为6.27 mm，几乎不生长，说明尿素会抑制菌丝生长。

2.5 不同温、湿度对分生孢子萌发的影响

分生孢子在20 ～30 ℃均可萌发，28 ℃时萌发率最高（72%）；其次为25 ℃（48.67%）；低于20 ℃和高于30 ℃，分生孢子不萌发（表5）。与菌丝生长结果相似，温度高于28 ℃，分生孢子萌发率急剧下降，30 ℃时仅为20.00%，较28 ℃时低52.00%。

表5 温度对桉树轮斑病原菌分生孢子萌发的影响Tab.5 Effects of different temperatures on conidia germination of P.eucalyptorum

桉树轮斑病原菌分生孢子在100%+水滴的条件下萌发率最高（62.00%），其次是相对湿度100%条件，萌发率为10%，在相对湿度低于100%的条件下均不能萌发，说明该菌分生孢子萌发对湿度要求较高（表6）。

表6 不同相对湿度对桉树轮斑病原菌分生孢子萌发的影响Tab.6 Effects of different relative humidity conditions on conidia germination of P.eucalyptorum

2.6 致死温度测定

菌丝经40、42、44 和46 ℃处理10 min 后，在PDA 平板培养基培养6 天后仍然能生长，随着温度升高，菌丝生长量减少，经48、50、52、54、56、58 和60 ℃处理的菌丝不能生长。分生孢子经过40、42、44、46 和48 ℃处理10 min 后，在PDA 平板培养基培养6 天后仍能萌发，长出菌丝，随着温度升高，萌发率降低；50、52、54、56、58 和60 ℃处理10 min 后，在PDA 平板培养6 天没有长出菌丝。因此，本试验确定该病原菌菌丝的致死温度为48 ℃，分生孢子致死温度为50 ℃。

3 结论与讨论

病原菌生物学特性是病害早期诊断、预测与防治的基础[11-12]。桉树轮斑病原菌P.eucalyptorum的生物学特性目前国内外未见报道。本研究结果表明，P.eucalyptorum菌丝在10 ～35 ℃均能生长，最适生长温度为28 ℃，低于10 ℃或高于35 ℃均不利于病原菌菌丝生长；分生孢子在20 ～30 ℃均可萌发，以28 ℃萌发率最高；分生孢子在饱和湿度且有水滴条件下萌发效果最好。这与广西桉树轮斑病发生规律相符。3—4月温度较低、雨水较多、湿度较大，越冬病原菌开始活跃，5—8月温、湿度较高，病害迅速扩展蔓延至高峰，9—11月持续高温或者连续晴天，病斑扩展缓慢或停止。说明温、湿度是影响林间病害发生和流行的主要因素。菌丝pH 生长范围为2 ～12，最适pH 为6，说明弱酸环境有利于菌丝生长，这与方中达[7]报道的真菌对培养基pH 值最适度为3 ～6 的结果相一致。菌丝在以乳糖和蔗糖作为碳源的培养基中生长最佳，阿拉伯树胶粉培养基中生长较差；氮源利用方面，菌丝在蛋白胨和酵母粉培养基中生长最佳，尿素培养基中生长最差。合理使用氮肥能增强桉树抗病性，减少病害发生，间接达到防治病害的目的，这与王义勋等[13]报道的油茶炭疽病病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）生物学特性得出的结论相同。光照能加速该菌菌丝生长，不同光照及时间处理结果有差异。该菌菌丝和分生孢子对温度敏感性存在差异，菌丝的致死温度为48 ℃，分生孢子致死温度为50 ℃，表明该菌的致死温度较高。本研究结果表明桉树轮斑病原菌菌丝生长受温度、pH 值、光照、碳源和氮源影响明显，病原菌对环境的适应能力较强。

本研究通过生物学特性试验基本明确了P.eu⁃calyptorum菌丝最适生长条件，该供试菌株在培养基上不产孢，且菌株衰退明显，不利于后续研究，可对P.eucalyptorum的产孢条件进行研究。