“通督启神”电针对SAMP8小鼠认知记忆功能及额叶区炎症因子表达的影响*

汪子栋,姜 婧,田会玲,刘 浩,王 顺,杨佳一,任菁钰,李志刚

(北京中医药大学，北京 100029)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年痴呆，是一种以记忆认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经退行性疾病，约占痴呆类型的70%[1]，属最常见的痴呆类型。据2018世界老年痴呆报告统计，全球现有5 000万痴呆症患者，2/3患有AD，平均每3 s增加1例新患者。到2050年，AD患者可能会增加到约1.25亿[2],已成为当今老年人的“流行病”。该病已成为继心脏病、肿瘤和脑血管疾病之后，致老年人死亡的第4大病因[3]。随着人口老龄化的加剧，因其高致残率、高发病率和高医疗成本等特点，已成为亟待解决的公共卫生问题之一[4]。AD的病理性特点主要以神经元外β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积形成的具有神经毒性的老年斑(SP)及神经元内过度磷酸化的Tau蛋白导致的神经纤维缠结(NFTs)为主要病理表现。但近30年来，以清除上述病理产物为目标的临床药物实验不断失败[5]。迄今为止，AD的病因及其保护机制均未阐释清楚[6]，尚无治疗AD的特效药物[7]。越来越多证据表明，中枢神经炎症与AD密切相关，且有研究显示，中枢炎症反应常伴随AD的整个病理过程中，过度应激免疫炎症反应被认为是加速AD进展的重要因素。研究显示，类固醇、非甾体类抗炎药物的使用可降低AD罹患率[8]，但也造成患者恶心、呕吐等胃肠道不良反应[9]，限制其广泛应用于AD的治疗。而针刺干预简便验廉且无副作用,已逐步广泛应用于临床相关神志疾病的治疗。基于“通督启神”，本研究从行为学、形态学和细胞分子学等不同角度，探讨“通督启神”电针法对SAMP8小鼠的治疗作用，意在初步阐明“通督启神”针法对SAMP8小鼠的额叶区炎症反应的内在作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 日龄220 d，SPF级雄性，快速老化小鼠(Senescence-accelerated prone mouse 8， SAMP8)30只。SPF级同源雄性抗衰老小鼠(Senescence-accelerated resistant mouse 1，SAMR1)10只，由北京中科泽晟科技有限公司提供[SCXK(京)2014-0003]。体质量约为(22±2)g，均在屏障环境动物室单笼饲养，自由进食、进水。实验前适应性饲养1周。室温(20±2)℃，湿度40%～70%，温度为(23±1)℃，12 h光照，排除饮食及环境等因素对实验动物产生的影响。

1.1.2 仪器 盐酸多奈哌齐(5 mg，国药准字：H20050978);电针仪(SDZ-V,华佗牌);无菌针灸针(0.18 mm×13 mm，中研太和);自制小鼠固定套、Morris水迷宫视频分析系统(WMT-100S成都泰盟);酶标仪(Thermo Forma,美国);ECLIPSE80i显微镜(尼康，日本);低温冰箱(海尔,中国)。

1.1.3 试剂 ELISA抗体试剂盒(proteintech):IL-1β(KE10003)、IL-6(KE10007)、IL-10(KE10008)；一抗proteintech：ICAM-1(10020-1-AP)、MMP-9(10375-2-AP)；即用型免疫组化UltraSensitiveTMSP试剂(兔)(KIT-9706，6ml，迈新);DAB显色试剂盒(DAB-0031，迈新);柠檬酸钠PBS粉剂;水合氯醛4%多聚甲醛(备KGIHC016CS);生理盐水。

1.2 分组与干预方法

SAMP8小鼠24只，按照体质量标号后随机分为3组，分别为电针组、药物组和模型组，每组8只，SAMR1小鼠8只作为正常对照组。“通督启神”电针组,用自制鼠套将小鼠固定，选取百会、印堂和人中3个穴位[10]，用一次性无菌针灸针。人中穴向鼻尖方向点刺，百会穴、印堂穴均向上平刺进针，进针深度约0.3 cm，胶带固定，针柄连接电针仪，疏波，频率2 Hz，电压2 V，电针强度以动物头部微颤为宜，留针15 min。药物组,将多奈哌齐按0.92 mg/kg剂量灌胃给药，使用时将药片粉碎，用蒸馏水溶解。正常对照组与AD模型组，在相同饲养条件下不作任何处理，电针组治疗时，对其他各组小鼠也需抓取，用相同规格鼠套束缚相同时间，保证外界处理条件一致。以上各组小鼠操作1次/d，共计15 d。

1.3 Morris水迷宫行为学检测

1.3.1 隐蔽平台实验 各组小鼠干预15 d后，进行水迷宫隐蔽平台实验，检测各组小鼠的空间学习能力。于120 cm×50 cm的圆形水池中进行。在水池壁4个象限分界处贴不同形状图案作为小鼠空间定位标识。在水池第一象限中央处，放入一9.5 cm×28 cm顶端为圆形的平台，保持位置固定。实验前加水至水面高于平台1～2 cm，控制水温(20±2)℃。水池上方安置的摄像机与图像采集系统相连，软件系统会实时记录实验各项指标。实验时，将小鼠随机从不同象限放入水池中。每次放入后立刻封紧实验设备幕布，保持安静，从图像采集系统观测小鼠情况，减少外界环境干扰所引起的实验误差。让小鼠自由游泳寻找平台。当小鼠爬上平台停留3 s以上系统会自动保存记录小鼠找到平台前的各项数据。小鼠爬上平台后，让小鼠在平台上停留10 s熟悉平台。若在60 s内未能找到平台， 则由操作者将小鼠引导至平台上休息10 s,逃避潜伏期记做60 s。然后将小鼠移开、擦干。放在白炽灯下烤5 min，放回笼内。每只动物每天训练4次，连续训练5 d。本实验随机选取小鼠第1～3象限入水的平均值作为当日的学习成绩。

1.3.2 空间探索实验 为检测各组小鼠的空间记忆能力，隐蔽平台试验结束后第2天，将平台撤出。将小鼠由原先平台象限的对侧放入水中，记录各组小鼠在原平台象限游泳路程，作为空间记忆的检测指标。

1.4 HE病理染色

各组随机抓取3只小鼠，心脏灌注4%的多聚甲醛，固定脑组织，全脑修块，标本脱水、透明和石蜡包埋，做冠状面切片，厚约4 μm。二甲苯脱蜡2×10 min，无水乙醇洗去二甲苯2×2 min，梯度酒精95%、80%和70%酒精各1 min复水，苏木素染色1～5 min，1%盐酸酒精分化20 s，1%稀氨水返蓝30 s，伊红染色20 s～5 min，自来水洗30 s，梯度酒精70%/80%/95%/无水乙醇，分别依次脱水20 s、30 s、2×1 min和2×2 min，二甲苯3×2 min，晾干，中性树胶封片留以观察。不同观测倍数下，每组随机取互不重叠的7个视野。

1.5 免疫组化法

每组取3块固定后的脑组织，石蜡包埋，沿冠状轴于视交叉处切片，厚为4 μm。二甲苯脱蜡15 min/次，共2次，按乙醇浓度为100%/100%(新)/95%/90%/80%/70%依次浸泡水化，5 min/次；枸橼酸盐缓冲液水浴加热至90 ℃后，修复15 min；待至室温，PBS洗3次，3 min/次；滴加内源性过氧化物酶阻断剂(迈新试剂1)，室温孵育10 min；PBS如上洗3次。滴加非特异性染色阻断剂(迈新试剂2)，室温封闭10 min；甩掉封闭液，滴加一抗：MMP-9、ICAM-1，4 ℃过夜；次日，PBS如上洗3次。加生物素标记的羊抗兔IgG聚合物(迈新试剂3)。室温孵育10 min，PBS如上洗3次。加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(迈新试剂4)；室温孵育10 min，PBS如上洗3次，加DAB显色液，显色1～2 min；自来水冲洗，苏木素复染20 s。自来水冲洗5 min，按照70%/80%/90%/95%/100%/100%(新)乙醇梯度脱水，二甲苯透明2次，各10 min；中性树胶封片。使用ECLIPSE80i显微镜(尼康)，用Leica系统连接并采集图像，在光镜下放大400倍，每组随机选取不重叠视野免疫组化染色图片，拍照统计分析检测指标平均光密度值。

1.6 ELISA检测额叶区炎症因子

行为学实验结束后，将各组小鼠称重后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.4 mL/100 g)，各组随机选取6只小鼠断头取脑，分离新鲜海马组织，PBS冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质。组织块称重，然后剪碎便于匀浆。按组织重量：PBS体积=1∶9的比例匀浆，匀浆时置于冰上。吸取匀浆液到离心管，按4 ℃ 12 000 r离心5 min，取上清，-80 ℃冻存备用。严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 行为学结果

2.1.1 定向航行实验结果 由表1可见，随实验天数的增加，各组逃避潜伏期时间均呈下降趋势。第1天各组SAMP8小鼠与SAMR1小鼠逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.01)。同一天各组比较，模型组与正常对照组比较，其逃避潜伏期显著延长(P<0.01)，表明SAMP8小鼠作为AD模型较为成功，可见其存在明显的学习记忆障碍。实验第1天，与模型组比较，药物组和电针组差异均无统计学意义(P>0.05)。但电针组和药物组从第3天开始，其逃避潜伏期相较模型组显著缩短(P<0.01)，但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),说明两种干预疗法均能缩短小鼠找到平台的时间，提升了AD模型小鼠空间学习能力。研究发现模型组、电针组在第4天时逃避潜伏期均有所升高，且电针组与模型组比较差异无统计学意义，经分析排除设备故障等原因，在第4天逃避潜伏期有所升高，提示小鼠体力下降。分析原因后发现是由于SAMP8小鼠训练时间间隔较短，体力尚未恢复。故第5天调整各组小鼠训练时间及顺序后，两干预组表现良好，逃避潜伏期较模型组显著缩小(P<0.05)。

表1 隐蔽平台实验各组小鼠5天逃避潜伏期比较

2.1.2 空间探索实验结果 由表2所示AD模型组原平台所在象限游泳路程显著低于正常组(P<0.01)。与模型组比较，电针组目标象限游泳路程明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。药物组目标象限游泳路程亦有所提高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 定向航行实验：目标象限运动路程比较

2.2 各组小鼠额叶HE染色结果

正常对照组额叶皮质神经细胞数量较多，形态正常，结构较完整，排列有序，胞浆丰富饱满，胞核染色清晰均匀，边界清晰，均匀整齐，胞核多呈圆形或椭圆形，细胞核仁明显，核膜清晰。与正常对照组相比，模型组神经细胞数量减少，锥体细胞排列紊乱，胞体缩小，细胞间结构松散，间距变大，少部分神经细胞出现水肿，有较多细胞核固缩深染或溶解，存在神经细胞坏死，脑组织衰老迹象明显。而无论从细胞数量、形态上，药物组、电针组相较于模型组，上述情况均有所改观。药物组虽可见少许神经细胞水肿，但细胞排列较为有序。两干预治疗组的神经细胞，边界明显，核固缩、深染现象减少，均更接近正常对照组。见图1。

图1 各组小鼠额叶区HE染色图像(400×)

2.3 各组小鼠额叶区ICAM-1、MMP-9的免疫组化染色结果

ICAM-1、MMP-9阳性表达呈深黄色或棕色(红色箭头所示)，从染色情况看，ICAM-1主要着色于细胞膜上，MMP9在胞浆与细胞外基质均有表达。肉眼观模型组、药物组阳性表达较为明显。除阳性蛋白表达外，各组间细胞排列、分布也出现了明显差异。正常对照组神经细胞数量较多，形态正常，结构较完整，排列有序，组织结构均匀整齐，而模型组则出现明显的炎性细胞聚集现象(黑色箭头所示)，炎症细胞增生围绕血管周围间隙，形成血管套。而药物组、电针组，虽也可看出炎性细胞聚集的趋势，但较之模型组有明显的改善，且两干预组的ICAM-1、MMP-9阳性蛋白表达与模型组相比较均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果详见图2～3和表3。

图2 ICAM-1在各组小鼠额叶区的染色情况(400×)

图3 MMP-9在各组小鼠额叶区的染色情况(400×)

表3 各组小鼠额叶区ICAM-1、MMP9表达情况

2.4 各组额叶区炎症细胞因子表达

见表4，模型组额叶区IL-1β、IL-6浓度值显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01)，药物组、电针组IL-1β、IL-6浓度值低于模型组差异有统计学意义(P<0.01)。而IL-10则相反，模型组显著低于正常对照组的表达差异有统计学意义(P<0.01)，与模型组比较，药物组、电针组可上调IL-10浓度，差异有统计学意义(P<0.01)，电针组与药物组比较差异有统计学意义(P<0.01)。从结果可看出AD模型小鼠额叶区促炎因子IL-1β、IL-6含量较高，IL-10含量偏低，而电针组与药物组可显著改善这一情况。

表4 各组小鼠额叶区IL-1β、IL-10和IL-6表达情况

3 讨论

额叶的功能与精神、语言和随意运动关系密切。额叶功能障碍涉及多种精神疾病，包括痴呆症、情绪障碍、自闭症与强迫症等[11]，习惯侧重于额叶对精神情绪调节的研究。而额叶调节功能广泛，其背外侧前额叶、眶额叶和前扣带回等区域主要与神经行为综合征有关[12]，额叶还具有调控执行、工作记忆、优先选择性与持续关注力、自我控制和计划等能力，与认知、学习和记忆等复杂行为关系密切。一般认为，海马是大脑记忆中枢，负责学习、处理和储存获取的信息，如对声、光和味觉等记忆事件的加工处理，可发挥“叙述性记忆”、固化长时记忆的功能，而额叶在巩固、存储新信息方面虽没实质性作用。但在时间先后的记忆上，情景记忆的组织和策略方面发挥至关重要的作用，在记忆输出的编码、提取和验证中是必不可少的[13]。额叶边缘区和海马体之间的连接为记忆过程提供了正面控制，在创造充满情感的记忆中发挥作用[14]。故选额叶作为研究目标，研究记忆、认知能力缺陷的发病机理是有一定研究价值的。

前期动物实验研究表明，电针可抑制海马区小胶质细胞过度活化[15]，利于海马区Aβ蛋白的清除，显示了“通督启神”电针干预的有效性，但仍缺少针对AD小鼠额叶区MMP-9、细胞间粘附因子(ICAM-1)等炎症相关因子对认知能力影响的实验证据。

基质金属蛋白酶(MMPs)与AD的发病机理密切相关。作为钙依赖性的含锌内肽酶，病理状态下，在炎性疾病、神经退行性疾病(如AD)的调控中起着重要且复杂的作用[16]。有AD危险标志物的认知健康个体，即支持AD的脑脊液生物标志物T-tau、P-tau和Aβ42水平或存在ApoE4等位基因的个体，其脑脊液(CSF)中MMP-9水平均高于无危险标记物的健康个体[17]。MMP-9的表达在AD脑内升高，且位于神经纤维缠结和淀粉样斑块周围。Aβ可通过促进神经元、胶质细胞诱导MMP-9的表达，MMP-9被认为参与降解Aβ。为此有研究专门验证，MMP-9是否对AD模型鼠具有保护作用,结果与设想相反，敲除MMP-9基因或应用MMP-9抑制剂的AD模型小鼠其认知障碍和神经毒性症状反而减轻，MMP-9抑制剂在AD治疗中具有一定的潜力[18]。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，是一种细胞表面糖蛋白，低浓度持续存在于白细胞和内皮细胞膜上。经细胞因子刺激后，浓度可显著升高。ICAM-1可由IL-1、TNFα诱导，在血管内皮细胞、巨噬细胞中表达[19]。ICAM-1是整合素LFA-1的配体，LFA-1是白细胞上的一种受体。白细胞被激活后可通过ICAM-1/LFA-1与内皮细胞结合。ICAM-1可介导细胞之间或细胞与基质间相互接触和结合，参与细胞的信号转导与活化、免疫应答。在促进炎症细胞的迁移、黏连、聚积和调节机体免疫反应[20-21]中起重要作用。在中枢神经中，活化胶质细胞可分泌相关炎症因子介导免疫反应。IL-1β、Il-6作为免疫反应初始调控因子，生理条件下可刺激免疫细胞正常增殖、分化，促进机体免疫清除。但在病理条件下，小胶质细胞向M1型极化，过度的神经毒性炎症级联反应，会加剧Aβ、NFT等AD病理产物的积聚，增强乙酰碱酯酶的表达及其活性[22]，使胆碱能神经元退化和功能下降。IL-10作为抗炎因子，可以抑制NF-KB的激活，从而抑制小胶质细胞介导的神经炎症反应通路，下调炎症反应, 可促进Aβ清除，促进神经元的修复[23]。通过抑制单核/巨噬细胞增殖、粘附、激活及多种促炎因子的合成、释放。对维持中枢神经系统免疫稳态发挥着重要作用[24]。

AD作为神经退行性疾病与全身慢性炎症密切相关[25]，出现临床症状15～20年之前，AD病理改变就已经开始[26]，研究显示，MMP-9参与了AD的早期发病，甚至在出现明显认知功能障碍之前。MMPs与神经元变性、SP和NFTs等早期AD病理产物密切相关[17]。由于AD前驱期临床症状隐匿，不易被确诊，而中后期常发展为不可逆退行性病变，而中枢炎症反应在AD初期就已发生，故早期抑制中枢炎症可能是预防AD的有效举措。针刺因作用途径广泛、操作简便和无毒副作用等特点，宜临床应用推广用于治疗、延缓AD的病理进展。现代医学认为慢性炎症的产生与炎性介质异常调控、免疫功能低下有关。机体需经多种途径参与慢性炎症的病理、生理过程。而针刺因其整体性、双向性和品质性调节机体的特点[27]。可通过调节机体神经-内分泌-免疫网络系统[28]，维持中枢系统免疫稳态，保护神经组织。额叶在记忆、认知行为中也发挥重要作用，其负责有关情境时序记忆、执行效力和保持专注等功能在认知过程中起到关键作用。AD患者也常伴有抑郁、焦虑等情绪和性格相关的行为改变，提示额叶与AD发病可能存在一定联系。而有关AD的治疗，从额叶角度切入的研究仍然较少。

本研究结果表明,“通督启神”电针法可有效改善SAMP8小鼠认知障碍，可能是通过抑制额叶区ICAM-1、MMP-9的表达，抑制免疫细胞的过度增生粘附、迁移和聚积，维持额叶区中枢炎症反应的稳态，减缓过度炎症反应对神经细胞的损伤，从而改善SAMP8小鼠的认知记忆能力。但本实验研究仍缺乏针对额叶特有功能如：执行效力、保持专注和层次性划分任务等功能的行为学实验评价。故后期需更加科学完善实验设计，客观准确地反应SAMP8小鼠认知能力的变化，深入探究免疫调节机制对额叶功能在AD进程中的作用，以期对AD的研究取得新进展。