夹脊电针对急性脊髓损伤大鼠脊髓组织P2X7R、NLRP3蛋白表达的影响*

梅继林，田秀燕，孙忠人

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

脊髓损伤(ASCI)是临床常见的突发机械性损伤导致不可逆的运动、感觉和自主神经功能损伤，给患者和家庭以及社会带来巨大的压力和负担。脊髓损伤目前是无法治愈的，最大限度的减少脊髓损伤后继发性并发症和增加残余功能是临床治疗重点[1-3]。现有的临床研究数据表明，电针夹脊穴对脊髓损伤有显著疗效[4-7]。P2X7R是一种ATP门控型离子通道，参与了细胞的多种病理生理过程[8-9]；NLRP3是当前研究中分析最透彻的Nod样受体家族成员，也是NLRP3炎症小体的受体蛋白[10]。细胞外ATP和P2X7R相结合产生寡聚化反应，使离子通道开放，进而激活NLRP3炎症复合体[11-12]。发生急性脊髓损伤后，大量的ATP通过损伤细胞作为趋化信号，致使P2X7R表达增加，NLRP3各组分表达测量结果升高，从而加重脊髓组织神经损伤[13]。综上，在治疗脊髓损伤过程中，核心思想是抑制NLRP3炎症小体活化和降低P2X7R表达。本实验选择夹脊电针治疗急性脊髓损伤大鼠，通过观察治疗后P2X7R、NLRP3等蛋白和基因表达的演化，以期获得相关治疗机制，为急性脊髓损伤的康复治疗提供合理的实验数据和理论支持。

1 材料

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 荧光定量PCR仪(Exicycler 96，韩国)；离心机(H-2050R，长沙，中国)；电泳仪(DYY-7C，北京)；电针治疗仪(KWD-808-Ⅱ型，英迪，中国)；针灸针(0.35 mm×13 mm华佗，中国)；镜拍照系统(OLUMPUS，DP73，日本)。

1.1.2 试剂 P2X7R(A10511，ABclonal，中国);NLRP3(WLH3383，wanleibio，中国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(WLA004，wanleibio，中国);PVDF膜(IPVH00010，Millipore，美国);ECL发光液(WLA003，wanleibio，中国)。

1.2 动物

本实验中动物选用SPF级雌性SD大鼠共72只，体质量(220±10)g，大鼠供应商：辽宁长生生物技术有限公司。实验前大鼠于实验室中进行为期1周的适应性饲养，大鼠分笼饲养，给予正常食水喂养。实验室环境采用12 h/d照明，室温控制(23±2)℃。按照国际实验动物指南标准，给予充分关怀。所有实验过程均获得动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 动物分组

大鼠随机分为模型组(Model)、假手术组(Sham)和夹脊电针组(EA)，每组大鼠再根据1 d、3 d、7 d和21 d4个时间点分为4个亚组，每个亚组6只，大鼠采用苦味酸染色法在其尾部制作标记以作区分。

2.2 各组大鼠处理方法

2.2.1 假手术组(Sham) 本组实验大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(所用浓度为3.5 mL/kg)，在实验大鼠被完全麻醉后，将大鼠以俯卧位固定在实验用手术台上，以T10脊髓节段为中心，去除脊柱附近的皮毛，皮肤常规消毒后，用手术刀沿脊柱正中线于T10上下作约3 cm长的切口，然后钝性分离皮下筋膜及肌肉组织，直至T9-11棘突清晰暴露于视野中，用小号手术剪剪掉棘突，手术钳横向咬除椎板，逐渐暴露出椎板下的脊髓，明胶海绵压迫止血，随后不做其他处理，先后缝合肌肉组织和皮肤。术后立刻给予大鼠生理盐水5 mL腹腔注射以补充体液，同时每日给予青霉素肌肉注射，1日2次，持续3天。每日同其它各组大鼠一同捆绑，常规饲养，不予其他处置。

2.2.2 模型组(Model) 脊髓损伤大鼠的动物模型制作方法为改良Allen’s打击法。方法：待脊髓组织完全暴露后，将5 g的消毒后砝码置于玻璃管中，垂直固定于脊髓正上方10 cm，然后垂直落下造成脊髓撞击伤，此时可观察到脊髓被撞击的部分迅速充血颜色变深至深红或红紫色，同时大鼠尾部出现一过性的不自主抽搐，表明脊髓撞击成功，然后按照与假手术组相同的方法缝合并作进一步处置。术后大鼠后肢运动功能出现异常，且下腹部触诊膀胱胀大确认造模成功。对实验大鼠使用青霉素肌肉注射，注射频率为每日早晚各1次，持续3 d。当麻醉后的大鼠苏醒后，对其进行BBB功能评分，选取评分结果在1～3范围内的大鼠纳入实验。模型制备成功后，仅进行正常捆绑操作，无任何其他处理。

2.2.3 夹脊电针组(EA) 当造模大鼠苏醒后，对大鼠的BBB功能评分进行测定，将符合得分要求的实验大鼠进行统计，并进行下一步夹脊电针治疗操作。夹脊电针操作：首先，将实验大鼠按照俯卧位姿势固定在操作台上(固定操作是防止大鼠逃跑或撕咬，以造成不良后果)。夹脊电针的穴位选取大鼠T9和T11两对夹脊穴，实验用针灸针规格为0.35 mm×13 mm，直刺腧穴下，深度4～5 mm，感觉针尖触碰到椎板，然后同侧夹脊穴接在同一组电针仪上，正极在上，负极在下，调节电针频率定为100 Hz，打开电针仪开关，缓慢转动电流调节旋钮至大鼠背部肌肉微弱抽动且没有剧烈挣扎为度，每天治疗1次，每次30 min。

2.3 标本采集

各组大鼠分别于4个时间点处置结束后，以10%水合氯醛注射进行腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，进行多聚甲醛灌注固定，随后在实验所用冰盒上提取损伤局部的脊髓组织，长度约4 cm，于4 ℃冰箱存放备用。

2.4 检测指标

2.4.1 BBB评分 观察各组大鼠运动功能恢复情况，各组大鼠治疗后，将大鼠置于空地上进行自由活动，由专业人员进行评估。

2.4.2 Western blot测定脊髓组织中NLRP3、P2X7R蛋白表达 按照将蛋白质抽提、定量、SDS-PAGE、转印、封闭、孵育一抗、孵育二抗和ECL底物发光、抗体剥脱、封闭、孵育内参抗体、孵育二抗、ECL底物发光的步骤，最后进行结果分析。

2.4.3 实时荧光定量PCR法测定脊髓组织中NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA表达 提取大鼠样本总RNA并测定各个样本中RNA浓度，将上述所得到的RNA样本由PCR仪进行反转录以得到对应的cDNA，由ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。

2.5 统计方法

采用SPSS20.0统计软件进行数据处理，所有计量资料均用均数±标准差表示，差异比较采用单因素方差分析(One-ANOVA)，检验方差齐性，方差齐时组间比较采用LSD法，方差不齐采用Dunnett’s T3法，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 夹脊电针对各组大鼠肢体运动功能的影响

Sham组BBB评分为21分，与Sham组相比，Model组和EA组在各时间点BBB评分显著降低(P<0.05)，表明脊髓损伤后大鼠出现肢体运动障碍；与Model组比较，EA组在治疗后BBB评分显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脊髓组织BBB评分变化

3.2 Western blot检测各组大鼠NLRP3、P2X7R蛋白表达

Model组、Sham组和EA组大鼠脊髓组织中NLRP3蛋白表达情况：Sham组大鼠脊髓组织的NLRP3蛋白表达水平较低，并稳定保持。与Sham组NLRP3蛋白表达比较，Model组在3 d、7 d和21 d的NLRP3蛋白表达显著升高，两组差异有统计学意义(P<0.05)；EA组脊髓组织NLRP3蛋白在3 d、7 d和21 d表达均低于Model组的NLRP3蛋白表达，两组NLRP3蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)。相关结果见图1、表2。

图1 各组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达(n=6)

表2 各组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达

Model组、Sham组和EA组大鼠脊髓组织中P2X7R蛋白表达结果：在1 d、3 d、7 d和21 d等各时间点上，Sham组大鼠脊髓组织中P2X7R的表达量始终保持在较低的水平，Model组大鼠的组织P2X7R蛋白表达于术后1 d、3 d和7 d开始升高，于21 d表达下降。在术后1 d、3 d、7 d和21 d时间点，Model组与Sham组比较，P2X7R蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。在夹脊电针后的3 d、7 d和21 d时间点，EA组大鼠脊髓组织的P2X7R的蛋白表达呈现明显下降趋势，与同时间内Model组P2X7R的蛋白表达结果相比，两组P2X7R的蛋白表达结果差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图2、表3。

图2 各组大鼠脊髓组织P2X7R蛋白表达(n=6)

表3 各组大鼠脊髓组织P2X7R蛋白表达

3.3 各组大鼠NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA表达

Model组、Sham组和EA组大鼠脊髓组织中NLRP3 mRNA表达：与Sham组NLRP3 mRNA表达比较，Model组大鼠脊髓组织NLRP3 mRNA在1 d、3 d、7 d和21 d各个时间点明显升高，两者NLRP3 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)，与Model组NLRP3 mRNA表达水平比较，EA组大鼠脊髓组织NLRP3 mRNA表达水平在术后3 d、7 d和21 d均下降，两者NLRP3 mRNA表达结果差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表4、图3。

表4 各组大鼠脊髓组织NLRP3 mRNA表达水平变化

图3 各组大鼠脊髓组织NLRP3 mRNA表达水平变化(n=6)

各组大鼠脊髓组织P2X7R mRNA表达情况：Sham组大鼠的脊髓组织中P2X7R mRNA表达在1 d、3 d、7 d和21 d共4个时间点均维持在少量而稳定的低水平。Model组大鼠组织P2X7R mRNA表达在术后1 d、3 d、7 d和21 d时间点升高。与Sham组比较，Model组P2X7RmRNA表达在术后1 d、3 d、7 d和21 d时间点升高，两者P2X7R mRNA表达差异具有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较，EA组大鼠脊髓组织P2X7R mRNA表达在术后3 d、7 d和21 d时间点下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表5、图4。

表5 各大鼠脊髓组织P2X7R mRNA表达水平变化

图4 各组大鼠脊髓组织P2X7R mRNA表达水平变化(n=6)

4 讨论

实验大鼠脊髓损伤主要以炎症和免疫反应为主，此类继发性损伤会引起大鼠相关细胞的功能改变，引起更多的神经细胞死亡，加重损伤程度。NLRP3包络衔接蛋白ASC及被激活可以裂解IL-1β和IL-18前体的效应蛋白Caspase-1，而产生活化形式的IL-1β和IL-18[14]。现有研究结果表明，急性脊髓损伤会激发NLRP3、Caspase-1和ASC等蛋白复合体。并且，脊髓损伤后，IL-18、IL-1β蛋白表达会升高，这种趋势会进一步加重脊髓损伤，上述研究结论说明NLRP3炎症复合体是导致急性脊髓损伤后各类炎症反应的核心因素[15]。

在脊髓损伤的中医学理论研究方面，通常认为脊髓损伤是由于督脉受损而导致经脉痹阻，气血运行不畅，阴阳失调，脏腑筋脉缺乏气血的濡养而痿废不用。夹脊穴内夹督脉，外邻膀胱经，处于正中线旁开0.5寸，针刺夹脊穴可以一针连通两经，振奋助阳，疏通督脉和膀胱经，以达到阴阳调和、气血通畅、脏腑筋脉得以濡养而功能复用，电针夹脊穴是治疗脊髓损伤的一种有效中医手段。在夹脊电针治疗过程中，外加电压会在夹脊穴附近产生强大的电场，这种电场能产生拮抗内生性损伤电流，此类电流的存在能阻止Ca2+内流，增加线粒体酶活性，稳定膜结构，从而阻断脊髓继发性病变促进神经功能恢复[15]。炎症反应是脊髓损伤后继发性损伤的重要组成部分，在脊髓损伤的早期阶段，减轻炎症反应是抑制继发性损伤、促进脊髓神经功能恢复的有效手段。邹氏等[16]研究表明，电针夹脊穴治疗大鼠脊髓损伤可有效抑制脊髓损伤后的炎症反应，改善脊髓损伤后大鼠的运动功能，其主要机制是通过降低IL-6、IL-1β的表达，并增加IL-10的表达，实现炎症反应的抑制。

本实验以急性脊髓损伤模型大鼠为研究对象，以夹脊电针为治疗手段，通过BBB评分观察各组大鼠脊髓损伤后肢体运动功能恢复情况，以蛋白印迹法和实时荧光定量PCR法测定P2X7R、NLRP3蛋白和基因表达变化为观察指标，探讨夹脊电针治疗急性脊髓损伤的可能作用机制。本研究实验数据表明，夹脊电针可以明显提高脊髓损伤大鼠BBB评分，改善肢体运动功能；在不同时间点，与假手术组相比，模型组大鼠脊髓组织中NLRP3、P2X7R蛋白表达显著升高(P<0.05)，表明脊髓损伤后，NLRP3、P2X7R蛋白呈高表达状态，经过夹脊电针治疗后，二者表达出现不同程度下降(P<0.05)；实时荧光定量PCR结果表明，假手术组中大鼠脊髓组织中NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA表达量少且稳定，模型组中NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA在3、7和21 d时间点表达升高(P<0.05)，而在同时间点内，夹脊电针组NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA的表达水平低于模型组(P<0.05)，这说明NLRP3、P2X7R参与了脊髓损伤过程，而通过夹脊电针的治疗，NLRP3、P2X7R表达能够得到降低，从而促进脊髓损伤恢复。也有研究证明脊髓损伤等神经系统疾病与NLRP3、P2X7R关系密切，NLRP3、P2X7R可在胶质细胞和神经元中表达[17]。本课题组前期研究表明[18]，夹脊电针能有效抑制ASC接头蛋白表达和NLRP3受体蛋白，降低促炎因子IL-18的释放，从而实现脊髓损伤后炎症反应的减轻，促进脊髓损伤后大鼠神经功能的恢复。综上，笔者认为夹脊电针可能是通过下调NLRP3、P2X7R的表达来发挥对脊髓损伤的治疗作用。

随着科技的进步和先进检测技术的更新，出现了越来越多关于脊髓损伤治疗的研究，从功能改变和基因表达等不同层面探讨脊髓损伤神经损伤再生修复，学科交叉综合治疗以最大限度地减轻脊髓损伤患者功能障碍，提高生活质量并使之重返社会始终是临床关注的重点。本实验基于P2X7R/NLRP3信号通路，通过夹脊电针抑制P2X7R、NLRP3表达的作用机制探讨，为临床上夹脊电针治疗急性脊髓损伤提供一定理论基础和实验数据支撑。