疮疡Ⅰ号外敷对大鼠糖尿病性溃疡的影响

梁学威，苑海刚，于天一

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

随着人民群众生活水平的日益提高，我国人口的饮食结构发生了巨大改变，伴随着这些改变，糖尿病发病率逐年增高，据统计，我国糖尿病发病率从1980年的不足1%，发展到2010年的超过10%，近年来还有进一步上升的势头[1]。

皮肤是糖尿病这个多系统疾病的一个复杂的靶器官。糖尿病患者因周围神经病变与外周血管疾病合并外来的机械压力，可引起软组织破坏，进而引发一系列问题，从轻度的神经症状、血管疾病到严重的溃疡、感染。根据Wrobel J S及Alavi A等的研究，糖尿病患者一生中有15%～25%的几率发生糖尿病性溃疡，一旦发生，创面迁延不愈，在经有效医学干预的条件下，5年复发率仍高达50%～70%，糖尿病患者因糖尿病性溃疡所导致的截肢率是普通人群的15倍以上[2-3]。该类截肢是目前非创伤截肢的主要原因之一。Pinto A等在其研究中认为,糖尿病性溃疡患者截肢后的病死率也明显升高，术后5年内的病死率高达70%[4]。

西医治疗该病常用以下方案：①代谢管理治疗，包括胰岛素或胰岛素联合其他药物等；②改善局部供血治疗，包括扩张血管药物、抗血小板及抗凝药物等；③手术治疗，包括下肢动脉腔内介入治疗(球囊扩展及支架等)、下肢动脉旁路移植等；④抗感染及抗炎治疗，包括应用各类抗生素等；⑤其他对症支持，包括止痛等[5-7]。但到目前为止，本病治疗方法没有取得更进一步的突破。

近年来越来越多的研究指出，从目前的临床实践和研究进展来看，中医药治疗糖尿病性溃疡显现出一定的优势[8-9]。黑龙江中医药大学附属第一医院赵钢教授经过长期的临床经验积累，创制了外用中药汤剂——疮疡Ⅰ号，用于糖尿病性溃疡的治疗，已经在临床工作中获得较好的效果。本研究观察该方外敷对大鼠糖尿病性溃疡的影响，旨在进一步验证其有效性。

1 实验材料与实验方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar雄性大鼠(南京君科生物科技有限公司)，选取1月龄，体质量(100±20)g，共30只。

1.2 分组方法

随机分成6组，每组各5只，将各组分别命名为：实验1组(A1组)、实验2组(A2组)、对照1组(B1组)、对照2组(B2组)、空白1组(C1组)和空白2组(C2组)。将A1、A2、B1、B2等4组，合计20只，进行建模；C1、C2等2组，合计10只,不建模。

1.3 饲养与建模

1.3.1 饲养条件

大鼠进食采用江苏省协同医药生物工程有限责任公司生产的实验用鼠60%脂肪供能高脂饲料，自由采食及饮水，室内自然昼夜照明，通风良好，室温18～23 ℃，相对湿度55%～75%。以该高脂饲料饲养4周。

1.3.2 糖尿病模型制备

禁食12 h，不禁水，4 ℃柠檬酸钠(北京酷来搏科技有限公司)缓冲液(0.1 mol/L，pH=4.5)稀释STZ (北京酷来搏科技有限公司)，35 mg/kg 一次性腹腔注射。72 h后使用血糖仪测量大鼠尾尖血糖，以随机血糖持续>16.7 mmol/L作为糖尿病大鼠成模标准。每2周测量一次尾尖血糖，随机血糖<16.7 mmol/L的大鼠予以剔除，对于血糖>27.0 mmol/L的大鼠，予精蛋白锌胰岛素注射液2 u，每日1次皮下注射，以保持糖尿病大鼠血糖水平稳定，从而排除血糖因素的影响并降低糖尿病大鼠的病死率。

1.3.3 糖尿病性溃疡模型制备

糖尿病大鼠饲养4周后，使用3%的戊巴比妥钠(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)溶液腹腔注射，使其麻醉，置仰卧位，用橡皮筋将其固定于手术板上。将糖尿病大鼠麻醉后背部备皮，作直径2.0 cm的圆形标记，在无菌条件下，用砂纸磨去标记处全层皮肤，并深达筋膜，形成创面，止血后充分暴露48 h，即成糖尿病性溃疡大鼠模型。

1.4 疮疡Ⅰ号药剂制备

选用黑龙江中医药大学附属第一医院中药局提供的饮片进行药物制备，饮片符合《中华人民共和国药典》2020版相关标准。组方：连翘100 g，黄芩50 g，赤芍30 g，当归30 g,苦参30 g。共5味，饮片加水2 000 mL浸泡24 h，武火煮沸后改用文火煎煮120 min，用纱布滤出煎液保存备用，再加水2 000 mL，同法煎煮，用纱布滤出煎液保存备用。将2次煎液均匀混合，减压浓缩至50 mL，置于4 ℃冰箱保存。外用前提前取出药液，放置至常温后使用。

1.5 治疗方法

实验组(A1、A2组)：均局部应用中药疮疡Ⅰ号无菌纱条外敷、无菌纱布包扎、塑料薄膜外包。

对照组(B1、B2组):无菌纱条外敷、无菌纱布包扎、塑料薄膜外包。

空白组(C1、C2组):不建模，仅进行麻醉及足部备皮，用无菌纱条外敷、无菌纱布包扎、塑料薄膜外包。

所有大鼠均每2日换药1次。

1.6 创面宏观指标

观察溃疡治疗前后的面积差异，共进行2次，于治疗第15天和第30天分别测量，第15天测量A1、B1、C1组，第30天测量A2、B2、C2组。

方法：到达规定日期后，乙醚麻醉大鼠，使用透明薄膜覆盖于创面表面，在薄膜表面用蓝色记号笔延创面外缘进行标记，取下薄膜，则得创面轮廓线。再将该薄膜覆盖于方格纸上，计取轮廓线内方格数，使用方格计数法求得面积(C组无创面，数值为0)。

1.7 超敏C-反应蛋白水平

观察溃疡治疗前后的血液超敏C-反应蛋白(hs-CRP)水平。共进行2次，于治疗后的第15天和第30天测量，第15天测量A1、B1、C1组，第30天测量A2、B2、C2组。方法：①使用已在前一步中麻醉并计取创面面积的大鼠。②取尾尖血后，使用标准试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司)，测得超敏C-反应蛋白水平。

1.8 创面炎性因子指标

观察溃疡治疗前后的创面促炎因子水平，包括促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18)和抑炎因子(IL-4、IL-10)。共进行2次，于治疗后的第15和第30天测量，第15天测量A1、B1、C1组，第30天测量A2、B2、C2组。方法：①将已在前一步中采集尾尖血后的大鼠处死。②使用组织钳夹取创面边界组织(C1、C2组取背部包扎部位皮下组织)。③使用ELISA标准试剂盒，测得相应炎症因子指标。

1.9 创面组织中NF-κB通路指标

观察溃疡治疗前后NF-κB蛋白表达水平。共进行2次，于治疗后的第15天和第30天测量，第15天测量A1、B1、C1组，第30天测量A2、B2、C2组。方法：①使用前一步中取得的组织。②称取约100 mg，加入RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司)200 mL，蛋白酶抑制剂PMSF(北京酷来搏科技有限公司)6 μL。③充分匀浆，以3 000 r/min离心20 min，吸取上清，即得蛋白质。④每个样品取30 μg总蛋白上样，经12%SDS-PAGE电泳，电转膜70 min (电压为110 V)，5%脱脂奶粉封闭3 h，一抗孵育过夜(NF-κB-p65为 1∶1 000，β-actin为1∶1 000)，TBST洗膜3次，相对应羊抗兔二抗孵育1 h，ECL法显影(试剂均来自南京森贝伽生物科技有限公司)。⑤采用Quantity One软件对蛋白条带进行结果分析。

NF-κB蛋白相对表达量=NF-κB-p65蛋白的灰度值/内参蛋白条带灰度值

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 创面宏观指标比较

治疗第15天和第30天，C组(包括C1、C2)未建模，健康无异常。A组(包括A1、A2)溃疡面积均有缩小。 A1与B1比较，A2与B2比较，溃疡面积缩小均具有统计学意义(P<0.05)。提示，疮疡Ⅰ号外敷能够促进创面愈合，减小创面面积。各阶段各组创面面积如表1所示。

表1 各阶段各组创面面积比较

2.2 临床炎症指标比较

治疗第15天和第30天，A1、B1两组与C1组比较，A2、B2两组与C2组比较，临床炎症指标(hs-CRP)均升高(P<0.05)。A1与B1比较，A2与B2比较，临床炎症指标降低均具有统计学意义(P<0.05)。提示，疮疡Ⅰ号外敷能够在一定程度上降低临床炎症指标(hs-CRP)，控制机体炎症水平。各组hs-CRP水平如表2所示。

表2 各组hs-CRP水平比较

2.3 创面促炎因子指标比较

治疗第15天和第30天，A1、B1两组与C1组比较，A2、B2两组与C2比较，创面组织促炎因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18)水平均升高(P<0.05)。A1与B1比较，A2与B2比较，创面组织促炎因子水平下降均具有统计学意义(P<0.05)。提示，疮疡Ⅰ号外敷能够在一定程度上降低创面局部促炎因子水平，抑制组织炎症。各组促炎因子水平如表3所示。

表3 治疗第15天和第30天各组促炎因子水平比较

2.4 创面抑炎因子指标比较

治疗第15天和第30天，A1、B1两组与C1组比较，A2、B2两组与C2组比较，创面组织IL-4水平均有降低(P<0.05)。A1与B1比较，A2与B2比较，IL-4水平升高均具有统计学意义(P<0.05)。

治疗第15天和第30天，A1、B1两组与C1组比较，A2、B2两组与C2组比较，创面组织IL-10水平均有升高(P<0.05)。A1与B1比较，A2与B2比较，IL-10水平升高均具有统计学意义(P<0.05)。提示：疮疡Ⅰ号外敷能够在一定程度上提高创面局部抑炎因子水平，抑制组织炎症。各组促炎因子水平如表4所示。

表4 治疗第15天和第30天各组抑炎因子水平比较

2.5 创面组织中NF-κB-p65蛋白表达水平的比较

治疗第15天和第30天，A1、B1两组与C1组比较，A2、B2两组与C2组比较，NF-κB-p65蛋白表达水平均升高(P<0.05)。A1与B1比较，A2与B2比较，创面NF-κB-p65蛋白表达水平下降均具有统计学意义(P<0.05)。提示，疮疡Ⅰ号外敷能够在一定程度上降低创面局部组织中NF-κB-p65蛋白的表达水平，抑制NF-κB通路，抑制炎症反应。各组NF-κB-p65蛋白的表达水平如表5所示。

表5 治疗第15天和第30天各组NF-κB-p65蛋白的表达水平比较

3 讨论

疮疡Ⅰ号组方为连翘100 g,黄芩50 g,赤芍30 g,当归30 g,苦参30 g，共5味。方中连翘具有清热解毒、消肿散结之功效，在本方中清热解毒，攻创面之毒，取邪去则正安之意，为君药。黄芩具有清热燥湿、泻火解毒之功效，辅助连翘，进一步增强清热解毒之功效，为臣药。赤芍具有清热凉血、散瘀止痛之功效，在本方中一方面协助连翘、黄芩清热，另一方面凉血化瘀，解除瘀阻，恢复局部血脉运行，为佐药。当归具有补血活血之功效，与赤芍合用，成活血化瘀之势，调理血脉，使血行通畅以养筋肉，为佐药。苦参具有清热燥湿之功效，一方面协助连翘、黄芩、赤芍以清热，另一方面燥湿创面，使腐肉得生，为佐药。诸药合用，以清热解毒、活血化瘀为基本治法，针对糖尿病性溃疡患者局部最常见的湿热下注之证进行治疗。

从现代医学的角度看，连翘具有降低NF-κB-p65表达，同时使MCP-1和IL-6表达水平下降的作用[10-14]。黄芩中的有效成分——黄芩素,可以通过减轻肾脏细胞炎症来延缓糖尿病肾病的进展，且与抑制炎症信号NF-κB通路的激活密切相关[15-19]。当归中的有效成分——当归多糖,可显著改善糖尿病神经病变大鼠的周围神经损伤状态，促进神经传导的恢复，其机制可能与阻断NF-κB信号路径的传导，降低炎性因子水平，减轻神经的氧化应激损伤有关[20-22]。

由上述内容可以导出，疮疡Ⅰ号应用于大鼠糖尿病性溃疡时所表现出的治疗作用，可能与其抑制了NF-κB-p65蛋白的表达水平，抑制NF-κB信号通路，进而在降低了创面局部促炎因子水平的同时提高了抑炎因子的水平，最终抑制了炎症水平有关。

本实验结果中，实验组与对照组比较，溃疡面积缩小、临床炎症指标降低、创面组织促炎因子水平下降、创面抑炎因子水平升高均具有统计学意义(P<0.05)，创面NF-κB-p65蛋白表达水平下降方面均具有统计学意义(P<0.05)。分别在宏观层面、临床指标层面、细胞因子层面、核因子蛋白层面验证了上述假设。

综上所述，应用疮疡Ⅰ号外敷，能够在一定程度上促进糖尿病性溃疡的创面愈合，具体表现为治疗前后局部创面面积的缩小、局部组织促炎因子水平降低、抑炎因子水平升高、血清hs-CRP降低。其机制可能与组方药物中的有效成分抑制了NF-κB信号通路有关，但具体治疗机理还需要进一步研究。