基于网络药理学研究红花治疗膜性肾病的分子机制

庞欣欣，石秀杰，彭紫凝，张雅歌，邢玉凤，韩佳瑞*

(1.河南省中医院，河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002；2.河南中医药大学第二临床医学院，河南 郑州 450046)

膜性肾病(membranous nephropathy,MN)是一种自身免疫性疾病，是仅次于IgA肾病的第二大原发性肾小球疾病[1]，约占成人原发性肾病综合征的1/3[2]。MN主要病理特征为肾小球基底膜免疫复合物沉积及基底膜增厚，临床起病隐匿，约有50%～75%大量蛋白尿的MN患者在10年内会发展为终末期肾脏病或者慢性肾脏病[3]。MN患者常常处于高凝状态，研究表明，高达1/3的MN患者会出现血栓风险[4]。现代医学对MN患者高凝状态的防治主要采用肝素、低分子肝素、华法林等药物，虽然有一定的疗效，但长期使用易导致出血、肝肾功能损害等不良反应。

中医药在MN的治疗中取得了许多成果，具有多靶点、个体针对性强、整体调节等优势[5]，愈来愈受到临床重视。中医学认为MN属于“水肿”“尿浊”范畴，MN的高凝状态属于“瘀血证”范畴，治疗上多采用活血化瘀类中药防治血栓和栓塞的形成与发展。红花是临床常用的活血化瘀中药，现代药理学研究显示其具有抗凝、改善肾微循环、降脂、保护免疫功能等作用[6]，常配伍或单独应用于MN的临床治疗，但其具体机制尚不清楚。本研究通过网络药理学的方法挖掘红花治疗膜性肾病的有效成分及作用机制，同时构建红花有效作用靶点与膜性肾病疾病靶点的蛋白相互作用网络，探索红花治疗膜性肾病的靶点。并进一步对这些靶点进行疾病-药物-分子-靶点互相作用的可视化分析、GO和KEGG富集分析，从而为红花治疗膜性肾病的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 红花有效成分筛选

通过检索中药系统药理学数据库和分析平台[7](Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)挖掘红花的所有化学成分，根据各个成分的吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)，即ADME参数筛选有效成分，其中筛选条件为药物口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug like，DL)≥0.18。

1.2 红花的作用靶点和MN的相关靶点检索

采用TCMSP数据库，以“CarthamiFlos”为关键词，预测筛选红花有效成分作用靶点。以“Membranous nephropathy”为关键词在GeneCards[8]、DrugBank[9]、DisGeNET[10]、GAD等数据库中筛选所有与MN有关的所有靶点。

1.3 蛋白互作网络构建和关键靶点筛选

String数据库可以预测蛋白质之间的相互关系并构建PPI网络，利用该数据库构建红花作用靶点与MN靶点的交集PPI网络并筛选核心靶点。筛选参数设置主要有：生物机体选择为人类，最低要求交互分数设置最高置信度0.4。

1.4 红花治疗MN网络调控可视化

基于红花和MN的蛋白互作靶点数据，引入红花可作用于MN的有效成分，采用Cytoscape 3.7.2软件把这些数据绘制成为可视化网络图。其中“圆形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“边”表示不同成分与靶点之间的关系，挖掘其相互之间的作用关系。即得到红花治疗MN的疾病-药物-分子-靶点调控网络图。

1.5 GO和KEGG富集分析

DAVID(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)数据库广泛应用于基因注释，可通过该数据库挖掘基因与疾病的相关性。通过DAVID工具对红花和MN交集蛋白靶标基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，得到红花治疗MN潜在靶点可能具有的生物学功能以及主要作用通路。校正统计学超几何分布定量(P.adjust值)来评估存在于各GO和KEGG注释中的蛋白生物学功能和通路富集情况的显著性，P.adjust值在图中颜色越红，则显著性越强。

2 结果

2.1 红花有效成分ADME分析

检索TCMSP数据库中红花所有成分，按照OB≥30%和DL≥0.18进一步筛选出红花有效成分22个，见表1。

表1 红花有效成分ADME分析结果

2.2 红花的作用靶点和MN的相关靶点检索结果

通过TCMSP数据库查找到22个红花的有效成分中，只有18个有效成分具有相对应的靶点，对这18个有效成分进行靶点基因注释，删去不具有基因名称以及重复靶点，得到187个有效预测药物靶点。在GeneCards、DrugBank、DisGeNET、GAD等数据库中筛选MN相关靶点，删除重复值，共得到3 191个与疾病相关的靶点。取红花和MN的有效靶点交集，得到128个共同靶基因，见图1。

图1 红花活性成分有效靶基因与MN相关靶基因

2.3 红花-MN作用靶点蛋白互作关系分析

取红花活性成分有效靶基因与MN相关靶基因的相互作用的128个靶点，采用String数据库进行PPI分析，得到2 384条PPI关系，见图2。取其中富集节点数目最多的前30个靶点，做出柱状图，得到前30个红花-MN核心靶点,核心靶点图见图3，主要有蛋白激酶、白蛋白、炎症因子、血管内皮生长因子、细胞凋亡相关因子等。

注：黄色：蛋白互作关系;黑色：基因共表达的关系;浅蓝色：蛋白同源性;深蓝色：基因共进化;红色：基因融合;绿色：基因临接。

注：横轴为富集节点数目，纵轴为靶点基因名称。

2.4 红花治疗MN网络可视化分析

通过Cytoscape软件进行红花治疗MN的网络的疾病-药物-分子-靶点互相作用的可视化分析。纳入上述PPI网络筛选的128个基因和分析筛选得到16个红花可用有效成分，同时在网络中加入疾病和药物使网络图更加直观。网络可视化图见图4。

注：六边形代表红花，菱形代表MN，三角形代表红花16个有效作用成分，圆形代表红花作用于MN的128个靶点。其中A代表4-[(E)-4-(3,5-dimethoxy-4-oxo-1-cyclohexa-2,5-dienylidene)but-2-enylidene]-2,6-dimethoxycyclohexa-2,5-dien-1-one；B代表7,8-dimethyl-1H-pyrimido[5,6-g]quinoxaline-2,4-dione；C代表poriferast-5-en-3beta-ol。

2.5 红花治疗MN的机制分析

通过DAVID工具对红花和MN交集蛋白靶点基因进行GO和KEGG分析，具体得到红花可治疗MN的作用靶点的生物学功能142种，综合分析后取前20种功能特性，得到红花有效成分靶点主要通过如DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶Ⅱ型特异性、细胞因子受体结合性、受体配体活性、细胞因子活性等治疗MN，见图5。得到红花治疗MN信号通路有158条，综合分析后取前20条信号通路。KEGG分析显示，红花治疗MN的有效靶点主要在晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products，AGEs)-受体(receptor of AGEs，RAGE)信号通路、人类巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atheroscierosis)、乙型肝炎(Hepatitis B)、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等，见图6。其中气泡或柱形图颜色越红，则校正P值越高，显著性越强，气泡大小越大或柱形越长，则该生物学功能或该通路富集的靶点越多。根据排名，找到这些靶点最关键的AGEs-RAGE信号通路图，同时用红色表示红花靶点在该信号通路上具体作用点，见图7(所有结果均符合P.adjust<0.05)。

3 讨论

近年来,我国膜性肾病的发病率持续上升,已由12%增长至50%[11]，具有病程反复、慢性迁延等特点，若得不到及时治疗可引起血栓栓塞、心血管事件风险、肾功能衰竭等并发症形成，严重影响患者生活质量及预后。静脉血栓栓塞是MN患者常见且严重的并发症，其导致的年死亡率高达10%[12]。静脉血栓栓塞临床多表现为无症状，且尚未形成血栓的MN患者是否进行抗凝治疗目前仍存在争议，因此常常影响治疗时机。

中医药治疗MN疗效肯定，在改善肾功能、减轻临床症状的同时，还可以减轻西药不良反应[13]。根据MN的临床症状，可将其归属于“水肿”“尿浊”“虚劳”等范畴。许多中医学者认为瘀血是MN的主要病机之一，临床常配伍应用活血化瘀药。邓跃毅教授提出MN患者体内沉积的免疫复合物以及大剂量激素治疗可成为损伤机体的“药毒”，认为膜性肾病患者常为“瘀毒共生”，主张活血、通络之法应当贯穿MN的治疗始终[14]。赵玉庸教授认为“肾络瘀阻”是MN的基本病机，临床擅用虫类药通肾络治疗MN，收效甚佳[15]。红花性辛温，归心、肝经，具有活血化瘀的功效，是临床常用的活血化瘀类中药[16]。红花在治疗MN中常被单独或者配伍应用，不仅可以改善MN常见的高凝状态，而且对蛋白尿也有良好的治疗效果[17]。目前红花治疗MN的机制尚不清楚，陈文军等[18]研究表明,红花黄色素注射液能够降低MN大鼠蛋白尿、改善血脂代谢并提高血浆蛋白水平，其机制可能与下调基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达有关。

注：“count”值代表与该生物学功能相关的靶点数量;P.adjust表示显著性。

注：横轴代表在该信号通路上的靶点数量;P.adjust表示显著性。

注：红色表示红花在信号通路上的作用靶点(原图来源于KEGG PATHWAY数据库)。

本研究应用网络药理学方法系统地预测了红花治疗MN的潜在分子机制，发现其具有多通路、多靶点的特点。本研究筛选红花的有效成分22个，模拟预测187个有效预测药物靶点和3 191个与疾病相关的靶点相互作用关系，取红花和MN的有效靶点交集，得到128个共同靶基因，“活性成分-靶点”网络分析结果显示，红花作用于MN的核心靶点主要有蛋白激酶1(AKT1)、白蛋白(ALB)、炎症因子白介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子(VEGF)、Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、细胞凋亡相关因子Caspase-3等，通过对以上核心靶点进行功能富集分析，发现红花主要通过以下这些生物学功能特性治疗MN，如DNA结合转录激活活性、细胞因子受体结合性、受体配体活动、细胞因子活性、血红素结合、四吡咯结合、RNA聚合酶Ⅱ型特异性等。

本研究进一步针对关键靶点进行通路富集分析，结果显示，红花治疗MN主要通过影响AGEs-RAGE信号通路、人类巨细胞病毒感染、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎。其中AGEs-RAGE信号通路为关键通路。AGEs-RAGE信号通路激活蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)，一方面PKC可以刺激下游细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)、JNK通路、AKT通路，导致激活蛋白-1(AP-1)、核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路激活，进而引起血管内皮生长因子(VEGF)、细胞黏附分子、炎症因子等的大量释放，导致机体损伤[19-20]。另一方面，PKC通路可激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)通路，刺激JNK通路，抑制凋亡抑制因子Bcl-2表达，促进凋亡因子Bax(Bcl-2-associated X protein)蛋白表达而导致细胞凋亡[21]。因此，红花可作用于AGEs-RAGE下游通路中的多个靶点发挥治疗作用。

综上所述，本研究通过网络药理学研究揭示了红花可能主要通过抗炎、抗细胞凋亡、促进血管生成等发挥对MN的治疗作用。但本研究还存在以下局限性：1)红花单独用于MN的临床或实验研究较少，主要通过与其他药物配伍来治疗MN，因此未来还可以探索红花与其他药物相互作用治疗MN的靶点及作用机制；2)目前红花对MN的研究部分使用注射液，因此本研究采用口服利用度来筛选红花有效成分具有一定的局限性；3)本文研究结果主要通过数据库预测红花作用于MN靶点的预测，今后还需进一步通过体内、体外实验进行验证。