利用二代测序技术进行近交系小鼠品系验证

王 勃，王 忠，连 军，周 蓓，吕晓敏，从美丽，赵效国

(新疆医科大学动物实验中心，新疆乌鲁木齐 830011)

实验动物是生物医学研究的基础和重要支撑条件。近交系小鼠是科研实验中最常用的实验动物之一，但繁殖代数的增加，繁育条件的偏差，残留的基因杂合及可能的基因突变会造成遗传背景发生改变，导致实验结果的差异，甚至出现错误的结果[1]。在较大规模饲养不同品系的近交系小鼠时，要保证品系的正确可靠，需对实验动物进行遗传学检测。目前，用于监测小鼠品系和遗传特征的方法主要是免疫标记和生化标记等表型检测方法，这些方法对于近缘品系(如各近交系的亚系)的近交系小鼠的区分能力不足，而且检测的指标数量也有限[2]，因此实验动物遗传质量的检测也从动物表型的研究渐渐趋向于对于 DNA 分子标记的探索，对小鼠基因组 DNA 序列的检测是最直接有效的遗传学鉴定方法，而且随着基因检测技术的进步，在 DNA 水平对实验动物进行遗传监测也是大势所趋[3-5]。

随着生物医学研究的不断发展和深入，为满足新疆地区教学科研对实验动物的数量需求和质量要求，新疆医科大学新建动物实验中心通过验收评审启用，从上海斯莱克实验动物有限责任公司重新引种繁育。在原有工作经验基础上，存在管理方式的改变和改进，以及饲养人员的变动。饲养繁育期间，曾出现过大小鼠脱毛的现象，通过改善饲料灭菌工艺和添加营养元素等方式，脱毛现象有所好转[6]。但随着繁殖代数增加，以及管理和饲养等因素的改变，是否存在遗传基因突变的情况是未知的。因此，为进一步探究近交系小鼠的遗传质量稳定，该试验通过二代测序技术，对生产群中的两个品系(Balb/cByJ 和C57BL/6J)小鼠的112 个SNP位点进行了分型研究，确认所饲养繁育的实验动物遗传质量稳定，为该地生物医学研究数据结果的准确性与重复性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 2017年5月，Balb/cByJ和C57BL/6J两个品系近交系小鼠引种自斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2017-0005]，饲养在新疆医科大学医学实验动物中心屏障系统环境[SYXK(新)2018-0002]。2019年9月，选取16只6周龄左右SPF级小鼠，Balb/cByJ的雌雄各4只，分别标记为B♂1、B♂2、B♂3、B♂4、B♀1、B♀2、B♀3、B♀4，C57BL/6J的雌雄各4只，分别标记为C♂1、C♂2、C♂3、C♂4、C♀1、C♀2、C♀3、C♀4，剪取1 cm尾巴用于DNA提取，置于-20℃冰箱备用。

1.1.2 主要仪器 PCR扩增仪(T100)，美国Bio-Rad公司产品；电泳仪(EPS 300)，上海天能科技有限公司产品；全自动紫外与可见分析装置(FR-200A)、生物电泳图像分析系统(FR-980B)，上海复日科技有限公司产品；微量紫外分光光度计(NanoDrop)，美国ThermoFischer公司产品。

1.1.3 主要试剂 PCR 引物(PAGE 纯化)，上海百力格生物技术有限公司产品；dNTP，上海有渔生物工程有限公司产品；PCR用Taq酶和缓冲液，该实验室自制；动物基因组抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 小鼠DNA提取使用动物基因组抽提试剂盒按照说明书进行。以10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察DNA质量，用微量紫外分光光度计检测浓度和质量后置于20℃冰箱保存。

1.2.2 多重PCR扩增目的片段 选取均匀分布于小鼠19条常染色体及X染色体上的112个SNP位点进行分型[7]，将112对引物等比例混合后稀释成0.2 mol/L的储存液备用。PCR反应体系(10 μL)包括:小鼠基因组DNA 15 ng～20 ng，20 mol/L dNTPs，10 mmol/L Mg2+，0.02 mol引物和0.5 U热启动Taq酶。按以下热循环程序进行第一轮多重PCR扩增：95℃热变性15 min；94℃ 30 s，60℃ 10 min,72℃ 30 s(4个循环)；再进行94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s(24个循环)。

1.2.3 第二轮PCR建库 第一轮得到的产物稀释10倍，用于第二轮建库PCR的模板。在第二轮PCR体系(20 μL)包含：模板10 μL，引物0.04 μL，20 mol/L dNTPs，10 mmol/L Mg2+和 0.5 U热启动Taq酶，按照以下程序进行建库PCR反应：95℃热变性15 min；94℃ 30 s，60℃ 4 min,72℃ 30 s(5个循环)，再进行94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 30 s(25个循环)，72℃ 10 min。扩增结束后，将PCR产物进行电泳检测，观察电泳条带是否均一，是否有杂带等。

1.2.4 利用二代测序平台进行SNP基因型检测 将经建库PCR扩增的文库上样电泳，电泳完毕后，割取目标片段，用凝胶回收试剂盒进行纯化。纯化产物精确定量并稀释至测序所需浓度。建库产物送苏州金唯智生物科技有限公司，用安捷伦2200毛细管电泳仪质控后进行高通量测序，使用机型为Illumina X-10。

1.2.5 测序数据分析和SNP鉴定 测序得到的原始数据经Illumina bcl2fastq软件转化为序列数据，结果以 Fastq文件格式存储。利用FASTQC[8]对原始序列进行质控，并根据条形码序列分离出所有样本。使用BWA(v0.7.12)和Samtools(v0.1.19)软件[9]鉴定SNP位点。过滤小于15×测序深度位点，杂合子判定标准为等位基因的序列读长比例在20%～80%。

2 结果

2.1 多重PCR产物的质量控制

30 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，观察二轮PCR产物的效果，确定每只小鼠样本都扩增成功，主带位于400 bp(图1)，用凝胶回收试剂盒回收主带。文库纯化后，以Agilent 2200对文库进行质控，主峰位置400 bp，质控合格(图2)。

M.DNA标准；1～16.B♀1、B♀2、B♀3、B♀4、B♂1、B♂2、B♂3、B♂4、C♀1、C♀2、C♀3、C♀4、C♂1、C♂2、C♂3、C♂4

图2 Agilent 2200检测结果

2.2 送检小鼠的SNP检测结果

对16只小鼠的112个SNP位点的扩增产物进行二代测序，得到有效读取数为6 118 873，每个位点的平均读取数为3 631，97个SNP位点在所有的小鼠中都被分型，另外15个SNP位点，至少在1只小鼠中没有分型结果，被检小鼠的这15个SNP的分型结果如图3所示。15个SNP在被检小鼠中的详细分型结果见表1。rs13476971，rs3668927，rs3685276，rs3693131和rs3694100等5个SNP只在C57小鼠中被检测出来，而rs13476630只在C57小鼠中被检测，rs6373756虽然在15只小鼠中都被正确分型但是在Balb/c小鼠中的平均读取数(4 272±1 404)远大于C57小鼠(254±88)。另外，还发现有些SNP位点的检测出现了性别偏差，比如，rs13484115和rs13484116只在雄鼠中被检测，而雌鼠中没有分型结果。

表1 未被全部检出的15个SNP的检测结果

图3 不完全检出的15个SNP在16只送检小鼠中的分型结果

2.3 送检小鼠的SNP分型结果

对所有送检的16只小鼠进行SNP分型结果见表2，结果显示，在检出的SNP位点未出现杂合子现象。小鼠样本的分型结果在Jackson数据库中能找到与其分型完全匹配的品系，品系名称为C57BL/6J或为Balb/cByJ。

表2 小鼠的SNP分型结果

3 讨论

在近交系小鼠的保种和繁育生产过程中，虽有严格的要求，但仍存在着发生遗传污染或遗传漂变等风险。一个外源的动物与近交系的动物意外交配会导致近交系动物遗传基因改变。这种类型的遗传污染，会导致等位基因突然和大量交换，特别是在具有相似毛色的品系之间[10]。无品系间遗传污染是近交系动物的基本要求，可通过定期开展生化标记检测进行监测。但同一品系动物在不同的地方独立繁育，也会发生遗传漂变产生亚系，可用分子遗传标记检测小鼠遗传状况。

随着对实验动物SNP检测需求的不断增加，用于遗传鉴定的新的SNP检测技术和手段也层出不穷。如施长根等[11]用熔解曲线法对小鼠单倍体细胞进行遗传性别的鉴别；Zhang Jian等[12]用靶向SNP测序检测了黄瓜的遗传多样性。我们通过多重靶向PCR结合二代测序[13]对近交系小鼠生产群中的16只小鼠进行了遗传稳定性的验证，相较于其它传统的形态学和免疫学等品系鉴定方法，这种SNP分型方法结果更为直观可靠，而且性价比高、特异性强，而且多重靶向平台用于SNP的分型已经得到了越来越广泛的应用[14-15]。所选的112个SNP涵盖了小鼠基因组的19条常染色体和1条性染色体(X染色体)，在近交系小鼠中具有较高的多态性，能够鉴定所有的近交系小鼠品系。

尽管不是所有的SNP位点在16只小鼠中都有分型结果，但每只小鼠至少有100个以上的SNP位点得到了验证，且均为纯合子，与公布的品系一致。但我们也发现用二代测序对这些SNP位点的检测有一些偏向性，比如有些SNP只在C57BL/6J或为Balb/cByJ中的一种品系的小鼠中被分型，而另一个品系的小鼠却几乎检测不到读取片段，而有的SNP位点在不同性别的小鼠中分型效率也存在很大差异。这些差异基本上是由第一轮多重PCR同时对112个SNP位点进行扩增时造成的，由于两个不同品系的小鼠在每个SNP位点扩增的PCR产物有1个碱基的差异，可能会造成PCR扩增效率的轻微差异，如果是单重的PCR反应，这种差异几乎不会对终产物造成可被观察到的影响，而对于多重PCR反应而言，随着反应的进行，多重反应之间的竞争会将轻微的扩增效率的差异不断地扩大，导致最终有一种产物检测不到[16]。

由于112个SNP位点是针对所有近交系小鼠品系设计的，对于某一个特定品系的小鼠定种的话，所需检测的SNP数量会远小于112个，因此在对这两个品系小鼠进行遗传质量鉴定时，并不要求所有112个SNP位点都有结果。通过分析该试验得到的结果，已经足够能鉴定出这16只Balb/cByJ和C57BL/6J小鼠都与其预期的品系一致。用多重靶向PCR结合二代测序技术进行SNP分型，能够对近交系小鼠的遗传特性进行快速准确的评估。