益生菌对锦鲤幼鱼生长性能及血液、肝脏和肠道组织中相关免疫基因表达的影响

史东杰，李文通，姜巨峰，王赛赛，朱 华*，张 欣

(1.北京市水产科学研究所暨国家淡水渔业工程技术研究中心，北京 100068；2.农业农村部都市农业(北方)重点试验室，北京 100097；3.渔业生物技术北京市重点试验室，北京 100097；4.天津市水产研究所暨天津市观赏鱼技术工程中心，天津 300221)

自20世纪90年代初，锦鲤养殖业成为我国渔业的重要经济产业。锦鲤(CyprinuscarpioL.)属大型观赏鱼类，以体格健美、色彩艳丽、泳姿优雅被誉为“水中活宝石”“会游泳的艺术品”。锦鲤主要从体型、体色、斑纹和游姿等多个指标进行鉴赏，在其他鉴赏指标相同的条件下，体型较大者则价值更高。此外，锦鲤鉴赏另外一方面主要体现在体色、斑纹等体表特征，但频繁发生的病害导致体表受损，产生的疤痕严重降低了锦鲤的观赏性，对锦鲤产业的可持续发展构成了较大的威胁。因此，寻找有效的生态预防措施，特别是能够增强锦鲤机体免疫力的内源性益生菌，就成为控制锦鲤病害发生的最有前景的方法之一。

锦鲤生活的水环境中存在着种类繁多、数量庞大的细菌群落。养殖水体中的细菌通过锦鲤摄食、呼吸等行为进入体内，不同种类和数量的细菌在锦鲤体内组织、器官内形成了一个复杂、动态的微生物系统。以消化道为例，一方面消化道内有益菌可调节肠道菌群，复合益生菌可使草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[1]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[2]和凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[3]肠道中有益菌数量增加，有害菌数量降低，可改善和平衡肠道菌群，促进个体发育；另一方面可抑制有害微生物生长，增强对致病菌的抵抗力[4]。同时，益生菌产生的细菌素具有广谱抑菌作用[5]。目前，在渔业养殖中应用的益生菌种类较多，其研究主要集中于对水质和组织器官的表观调节作用，而对鱼类生长和相关免疫基因表达的影响研究报道尚少。

本课题组前期研究表明，复合益生菌(枯草芽孢杆菌∶丁酸梭菌∶粪肠球菌=1∶1∶5)可使锦鲤亲鱼繁殖性能和仔鱼成活率显著提高。以益生菌为主要成分的微生态制剂可使锦鲤获得最优的生长性能，并具备良好的免疫力[6]。然而，在锦鲤幼鱼阶段，其益生菌的需求量对机体生长和免疫能力的响应是否与亲鱼一致呢？本研究选用初始体重为248.13 ± 4.71 g锦鲤幼鱼，就益生菌对其生长性能和相关免疫基因表达进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用鱼 试验用鱼来自北京市水产科学研究所小汤山良种繁育中心自行培育的红白锦鲤幼鱼400尾，初始体质量为147.22±4.51 g。试验鱼暂养于小型循环水养殖池(3.2 m×1.8 m×1.5 m)中，水深1.2 m。养殖水温为24±2℃，pH 7.4～7.8，溶解氧5 mg/L。每日投喂2次(9:30～10:00、17:00～17:30)，日投喂量为鱼体重的2%～3%，根据鱼体的摄食、水温和天气变化情况等做适当调整。试验暂养7 d，正式试验期60 d。

1.1.2 益生菌 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)由渔业生物技术北京市重点试验室从健康锦鲤消化道中分离得到，纯化后进行发酵培养，并收集菌体，测定菌液浓度，活菌量分别达到了109CFU/mL。枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌按照一定比例分别进行单一菌种和复合菌种添加到饲料中，复合菌数比例按1∶1∶5进行复配，因3种菌的活菌量一致，将菌数比转化为体积比进行复配，复配后活菌量仍为109CFU/mL。

1.1.3 饲料制备 基础饲料购于北京三友创美饲料科技有限公司，营养成份为粗蛋白38.2%、粗脂肪22.3%、粗灰分11.4%、水份3.5%。免疫饲料：取1.1中单一菌种和复配菌液以活菌数(CFU)/饲料重(mg)分别喷洒到基础饲料中，阴干，使饲料中含菌总量达到109CFU/mg，从而制得枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌和复合菌落数比例为1∶1∶5的4种益生菌饲料。菌液和饲料于4℃冰箱中保存备用。每7 d涂平板计数，检测免疫饲料中益生菌含量在试验期间是否达到要求(菌含量达到109CFU/mg视为合格)。

1.1.4 主要试剂 总RNA提取试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品；TransScript Green qPCR Super MIX试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.5 主要仪器 平板计数器(Vi-CELL XR)，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司产品；超低温冰箱(DW-86L288)，海尔集团产品；总RNA提取试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品；电泳仪(DYCP-31BN)，北京六一生物科技有限公司产品；荧光定量PCR仪(MA-6000)，苏州雅睿生物技术有限公司；TransScript Green qPCR Super MIX试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 锦鲤幼鱼暂养7 d后，随机挑取个体均匀、健康无病的300尾分配到15个网箱(1 m×1 m×1 m)中，共5组，每组3个平行，每个平行20尾。对照组为A组，投喂试验基础饲料。取1.2中4种复配菌液以活菌数(CFU)/饲料重(mg)分别喷洒到饲料中，晾干，使饲料中含菌最终浓度为109CFU/mg，从而制得复合益生菌、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌的四种含有益生菌的饲料，分为B、C、D、E 4个试验组。所有组别按照暂养条件管理。

1.2.2 生长指标分析 于试验开始前和养殖试验结束后，禁食24 h，分别称取对照组和试验组锦鲤幼鱼的体质量，并记录试验期间各组锦鲤幼鱼的成活率、饲料投喂情况。选用增重率、特定生长率、饲料系数、成活率作为主要生长性能指标，具体计算方法如下：

增重率(WGR，%)=(终末体重-初始体重)/初始体重×100；

特定生长率(SGR，%/d)=(ln终末鱼体重-ln初始鱼体重)/饲养天数×100；

饲料系数(FCR)=总投喂量/(终末体重+死鱼重量-初始体重)；

成活率(SR，%)=试验末鱼尾数/试验初鱼尾数×100。

1.2.3 免疫相关基因的表达量分析

1.2.3.1 样品总RNA提取和cDNA合成 养殖试验60 d后，随机选择8尾作为样本采集鱼，先用浓度为0.1 g/L的MS-222麻醉后，采用常规方法尾静脉取血，放入RNase-Free的1.5 mL EP管内，于液氮速冻后放入-80℃冰箱中保存备用。解剖出内脏，于肝脏、肠道迅速取一小块用锡箔纸包好后速冻，保存方法同尾静脉血。采用Trizol 法分别提取血液和各组织的总RNA，用Nandrop 2000c 定量检测总RNA的浓度和质量，20 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，放入-80℃冰箱中备用。应用试剂盒TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix进行锦鲤幼鱼血液和各组织的cDNA第一条链的合成。

1.2.3.2 实时荧光定量PCR分析基因表达 锦鲤幼鱼免疫相关基因，内参基因β-actin正向和反向引物序列见表1，使用的引物序列参考文献[7]，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。实时荧光定量PCR按照试剂盒TransScript Green qPCR Super MIX说明书，反应条件为：95℃ 30 s进行预变性；95℃ 10 s、60℃退火延伸20 s，45个循环；反应后72℃上升至95℃，每升高1℃采集信号，测定熔解曲线检测反应的特异性。4种基因表达结果采用2-△△Ct法进行计算。

表1 锦鲤幼鱼免疫相关基因与内参基因β-actin引物序列

1.2.4 数据统计与分析 试验数据用平均值±标准差(means±SD)表示。采用SPSS16.0软件进行数据统计和分析，做单因素方差分析(One-way ANOVA)，若差异显著，用Duncan分析进行多重比较，显著差异水平为0.05。

2 结果

2.1 益生菌对锦鲤幼鱼生长性能的影响

表2显示，单一菌种和复合菌种的益生菌对锦鲤幼鱼的生长均有促进作用。与对照组A组相比，各益生菌添加组的WGR、SGR均显著增加(P<0.05)，其中复合益生菌添加组B组WGR最高为38.13%，其次为添加枯草芽孢杆菌组C组为34.66%，B组SGR较对照组提高25.58%。但添加丁酸梭菌组D组FCR与对照组相比无显著差异(P>0.05)，其他添加组则显著降低(P<0.05)。不同添加组对成活率无显著影响(P>0.05)。

表2 益生菌对锦鲤幼鱼生长性能的影响

2.2 益生菌对锦鲤幼鱼免疫相关基因的表达量的影响

表3显示，饲料中添加单一菌种和复合菌种的益生菌对锦鲤幼鱼血液中proPO mRNA相对表达量受影响明显，在B组复合益生菌添加组较对照组升高3倍之多(P<0.05)，而C组、D组虽然较对照组相比有所增加，但未产生显著变化(P>0.05)。各试验组添加益生菌投喂后，锦鲤幼鱼血液中LZM mRNA相对表达量发生显著变化(P<0.05)。与对照组相比，B组复合益生菌添加组升高2倍之多(P<0.05)。与对照组相比，益生菌投喂组锦鲤幼鱼肠道中GST mRNA相对表达量有所升高，B组复合益生菌添加组升高了32.45%(P<0.05)，而E组粪肠球菌升高了3.45%，差异未达到显著水平(P>0.05)。饲料中添加益生菌后，锦鲤幼鱼肝脏中Hepc mRNA相对表达量发生显著变化(P<0.05)，复合益生菌添加组B组较对照组升高了76.82%(P<0.05)，其他试验组也呈显现显著升高(P<0.05)。

表3 益生菌对锦鲤幼鱼免疫相关基因的表达量的影响

3 讨论

3.1 饲料中添加益生菌促进锦鲤幼鱼的生长

本试验所采用的枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌由本试验室自行生产，这些作为益生菌使用的物质属于非致病菌。当该物质混合或者单一添加到饲料中投喂锦鲤幼鱼60 d，其促生长作用主要是通过增重和饲料利用来体现。在本研究中，单一菌种和复合菌种的益生菌对锦鲤幼鱼的生长都具有促进作用。与对照组相比，各益生菌添加组增重率和特定生长率显著增加，而饲料系数明显降低。说明益生菌对锦鲤幼鱼的促生长作用主要通过增加体重，降低饲料系数来体现。樊英等对凡纳滨对虾(Cyprinuscarpio)[7]、徐晨等对异育银鲫(Carassiusauratus)[8]、刘淑兰对大西洋鲑(Salmosalar)[9]的研究均得出类似结论。这可能是由于：①益生菌具有增强肠道蛋白质消化酶活性作用，可促进机体对外源营养物质的消化吸收，进而增强了锦鲤的食欲；②益生菌具有调节肠道和机体微生态平衡的功能，从而提高免疫力，增强机体代谢水平；③益生菌具有抗氧化、抗炎等多种生物活动功能，减轻应激反应，保持机体处于健康状态，从而促进生长。在已有的研究中发现，复合益生菌的添加比单一益生菌更能促进水产动物生长[10]。如在本试验中，复合益生菌对锦鲤幼鱼的生长性能最佳，其主要由枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌按照1∶1∶5进行复配而来。而就生长性能而言，促生长功能排序为：复合益生菌>枯草芽孢杆菌>粪肠球菌>丁酸梭菌。综合复合益生菌的配比和试验结果来看，粪肠球菌在复合益生菌中的配比较高，但单一使用粪肠球菌投喂锦鲤幼鱼的促生长作用却弱于单一枯草芽孢杆菌饲料添加组。刘翠玲[11]用粪肠球菌(600 mg/kg)、枯草芽孢杆菌(300 mg/kg)分别饲喂鲤鱼幼鱼(12.54 g±0.03 g)8周，发现两种添加剂对鲤鱼幼鱼的生长和消化均具有显著的促进作用，且枯草芽孢杆菌添加剂的促进作用优于粪肠球菌，该研究结果与本研究一致。但还应补充环境条件、菌种协同互补及锦鲤幼鱼促生长代谢机理方面的研究。益生菌的种类繁多，对水生动物生长的促进作用也具有不同的效果[7-11]，本研究与已有的研究相比也证实了此观点。

3.2 饲料中添加益生菌增强锦鲤幼鱼免疫功能

通过本文的投喂试验证实，枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌单一菌种或复合菌种添加到饲料中，可以不同程度的提高proPO、LZM、GST和Hepc免疫基因的表达。投喂复合菌种的试验组更是显著提高了锦鲤幼鱼相关免疫基因的表达，说明复合益生菌的投喂为锦鲤幼鱼提供了更强的免疫刺激。原因可能是活菌能在鱼体血液、肠道和肝脏定殖，并能刺激非特异性免疫系统，从而提高机体免疫力，这一研究结果与Vazirzadeh A对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的研究结果一致[12]。酚氧化酶原(proPO 系统)是鱼类体液免疫特异性因子之一，可产生活性酚氧化酶(phenoloxidase,PO)，参与机体防御功能，可在先天免疫系统中发挥着重要作用。溶菌酶(lysozyme,LZM)广泛分布在鱼体内，可破坏革兰氏阳性菌细胞壁成份，从而促使机体能够抵御病原微生物入侵。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是鱼类重要Ⅱ相去毒酶之一，在催化外源毒素与还原谷胱甘肽(GSH)去毒代谢等过程中具有关键的调控作用。鱼类抗菌肽(hepcidin)是一类含有Cys的抗菌肽，具有广谱抗菌作用，在鱼类肝脏中表达量最高。众多学者推测，鱼类hepcidin可能在抵抗病原微生物防御系统中发挥重要作用。国内外研究结果显示，何伟聪等[13]在军曹鱼幼鱼基础饲料中添加枯草芽孢杆菌进行投喂试验，其血清LZM表达量显著上调；杨虎城[14]报道了用含有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)和粪肠球菌的试验饲料投喂罗非鱼40d，结果显示免疫相关基因均显著表达。孙艳等[15]报道了用含有芽孢杆菌(Bacillus)/溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的饲料投喂凡纳滨对虾，可显著提高血淋巴细胞中proPO、SOD和LZM的相对表达量，并表明饲料中添加芽孢杆菌和溶藻弧菌复合益生菌使用更能提高对虾抗SSV感染能力。Chiu C H等[16]报道了乳酸菌作为益生菌添加到饲料中，可显著提高凡纳滨对虾proPO 6.1倍。Lui K F等[17]报道了在对虾(Penaeuschinensis)幼体养殖用水中添加一定量的枯草芽孢杆菌，可显著提高活性酚氧化酶的表达量。这些研究报道与本文用枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌单一/复合益生菌投喂后可显著提高锦鲤幼鱼相关免疫基因表达量结果一致。本研究选择的4种免疫基因都是参与鱼类非特异性免疫反应的主要蛋白，结合4种基因的相对表达量结果分析，表明外源益生菌的补充，能够显著提高锦鲤幼鱼免疫因子的表达量。

综上所述，在饲料中添加单一/复合益生菌，均可有效提高锦鲤幼鱼的生长性能，以复合益生菌使用效果更好，且proPO、LZM、GST和Hepc免疫基因相对表达量在不同程度上均高于对照组，可见枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌可以作为益生菌应用于锦鲤养殖。