一株猪链球菌8型菌株的分离鉴定及其生物学特性研究

田向学，董志民，李富强，任卫科，池晶晶，张 莉，张 蕾，崔尚金，鄢明华*

(1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；2.农业农村部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站，天津 300381；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

猪链球菌(Streptococcussuis，SS)是猪链球菌病的病原，可引起病猪表现脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症和肺炎等多种症状。SS为革兰氏阳性球菌，多呈链状排列，无芽孢，能形成荚膜。根据菌体荚膜多糖结构的不同，SS分为33个血清型(1-31型，33型，1/2型)[1]，其中SS1/2、SS1、SS2、SS7和SS9型菌株的临床分离率较高，而且不同血清型在我国不同地区的分布和范围均有不同[2-5]。不同血清型的SS临床分离株中，2型菌株的毒力最强，是一种重要的人兽共患病病原[6]。

国内外对SS毒力因子及致病机制的研究大多集中在2型SS，对于8型SS主要局限于流行病学调查[7-8]。本实验室从天津地区的发病猪组织病料中分离到1株SS，经鉴定为血清8型。通过对该分离菌株的培养特性、生化特性、耐药性和致病力等特性研究，为进一步研究SS 8型的致病机理奠定了基础，为临床开展猪链球菌病的防控与治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 天津地区某猪场送检疑似猪链球菌病例发病猪组织病料。

1.1.2 主要试剂 premixTaq(RR901A)，宝生物工程(大连)有限公司产品；哥伦比亚血琼脂平板(200508)，比克曼生物科技有限公司产品；THB培养基(HB0311-3)，青岛海博生物技术有限公司产品，Gibico胎牛血清(A3160801)，上海觅拓生物科技有限公司产品；药敏纸片(C074)、细菌微量生化反应管(A203)，均为杭州滨和微生物试剂有限公司产品；SS8型标准阳性血清(Z126)，中国兽医药品监察所产品；细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)，天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 垂直层流洁净工作台(HCB-1300)，青岛海尔特种电器有限公司产品；恒温培养箱(ZXMP-A1430)，上海智城分析仪器制造有限公司产品；台式离心机(TGL-16M)，湘仪离心机仪器设备有限公司产品；Applied Biosystems Veriti热循环仪器(4452299)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；伯乐凝胶成像系统(Gel Doc 2 000)，美国Bio-Rad公司产品；细菌浊度仪(WGZ-2XJ)，上海昕瑞仪器仪表有限公司产品。

1.1.4 实验动物 18 g～20 g清洁级昆明小鼠，购自军事医学科学院实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的初步分离 无菌采集发病猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、关节液等，接种于哥伦比亚血琼脂平板，37℃培养18 h，选取疑似链球菌形态的菌落进行革兰氏染色、镜检，挑选革兰氏阳性、链状或成双存在的单个菌落进行菌株纯化，用含50 mL/L胎牛血清的THB培养液培养已纯化菌株，用400 mL/L的甘油保存菌液，备用。

1.2.2 16S rDNA基因PCR鉴定 取上述保存菌液100 μL接种于10 mL THB培养液，37℃、150 r/min振荡培养6 h，制备菌液样品。以细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌液样品全基因组DNA为模板，参照文献[5,9]委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成猪链球菌16S rDNA特异性鉴定引物(表1)，采用PCR方法进行扩增。扩增程序：95℃ 5 min，(94℃ 30 s，Tm 30 s，72℃ 30 s)×30循环，72℃ 7 min，16℃终止。PCR产物应用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果阳性的产物回收后送天津金唯智生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI网站进行Blast比对分析。

1.2.3 生化试验 取分离菌株THB培养物和高压灭菌去离子水(阴性对照)各 20 μL，分别接种于细菌微量生化反应管中，置于37℃恒温培养箱静置培养48 h，观察细菌微量生化反应管的颜色变化，分析菌株生化反应特性。

1.2.4 血清型鉴定

1.2.4.1 玻片凝集试验 参照GB/T 19915.2-2005《猪链球菌2型分离鉴定操作规程》[10]中平板凝集试验操作规程：取上述保存菌液30 μL接种于3 mL THB培养液(含50 mL/L胎牛血清)，于37℃摇床，振荡培养18 h。取1.5 mL培养物，经10 000 r/min离心3 min后弃上清，用100 μL生理盐水将沉淀悬浮。取25 μL菌悬液分别和等体积理盐水、SS 8型标准阳性血清作玻片凝集试验，其中生理盐水作为阴性对照并观察待检菌株是否有自凝现象。在生理盐水对照不凝集，阳性菌株凝集的情况下，4 min内若待检菌株出现肉眼可见凝集则为阳性。

1.2.4.2 菌体荚膜多糖基因PCR鉴定 参考文献[11]合成我国已报道的 SS 血清型(1、2、3、7、8、9、21型)PCR 鉴定引物(表1)，以上述提取的分离株DNA为模板，采用PCR方法进行扩增，扩增程序：95℃ 5 min，(94℃ 30 s，Tm 30 s，72℃ 30 s)×30循环，72℃ 7 min，16℃终止。PCR产物应用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测产物送天津金唯智生物科技有限公司进行测序，对测序结果进行Blast比对分析。

1.2.5 药敏试验 采用纸片扩散法，将纯化后的菌株接种于含20 mL/L牛血清的THB营养肉汤，于37℃摇床振荡培养18 h，灭菌生理盐水调整浊度为0.5 MCF的菌液均匀涂布于哥伦比亚血琼脂平板上，37℃静置培养24 h后，参照美国临床和实验室标准化委员会标准(CLSI)对结果进行判读。

1.2.6 致病力试验

1.2.6.1 菌液的制备 将纯化后的菌种接种于含有50 mL/L胎牛血清的THB培养液中，于37℃摇床振荡培养18 h，6 000 r/min离心10 min，弃去上清，用THB培养液重悬菌沉淀。参照文献[9]取200 μL菌悬液加THB培养液至2 mL配制成菌悬液，并进行10倍倍比稀释，以平板表面涂布法计数菌落总数(CFU/mL)，根据计数结果将菌悬液稀释至合适浓度备用。

1.2.6.2 动物分组及感染试验 选取60只18 g～20 g清洁级昆明小鼠随机分为7组，其中攻菌组分为5组，每组10只，灭菌THB培养液组和空白对照组各5只。参考前期的试验结果[12]，采用腹腔注射方式，注射剂量为1 mL/只，分离菌株的攻菌剂量分别为4.0×108CFU/mL、2.0×108CFU/mL、1.0×108CFU/mL、5.0×107CFU/mL和2.5×107CFU/mL。攻菌后连续观察12 d，记录小鼠临床症状、发病率和死亡率，按照(LD50=lg-1[Xm-i(∑P-0.5)])[13]方法计算分离菌株对昆明小鼠的半数致死量(LD50)。小鼠死亡后，及时采集心、肝、脾、脑组织进行细菌分离培养、染色、镜检及cps8K基因PCR检测。

1.2.7 毒力基因检测 参考文献[14-15]合成SS 7个主要毒力基因(gdh、gapdh、sly、fbps、orf2、epf和mrp)，以上述提取的分离株DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增引物序列见表2，引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。PCR扩增反应体系(20 μL)：模板0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，premixTaq酶10 μL，高压灭菌水8.5 μL；反应条件：95℃ 5 min，(95℃ 30 s；退火Tm 30 s，72℃延伸1 min)×30个循环；72℃ 7 min，16℃终止(不同毒力基因的退火温度Tm参考表2)。扩增产物应用10 g/L的琼脂糖核酸凝胶电泳进行检测，将筛选出的特异性目的片段样品进行产物回收、测序，依据核苷酸比对结果进行分析。

表2 猪链球菌主要毒力基因检测PCR扩增引物序列

2 结果

2.1 细菌分离培养

从发病猪肝脏、肺脏、淋巴、脾脏等病料中均可分离到比较纯净的细菌，分离菌株在哥伦比亚血琼脂培养基上生长良好，菌落呈针尖大小、灰白半透明、表面光滑、中间隆起且伴随α溶血状态。挑取疑似菌落进行革兰氏染色、镜检，结果显示分离菌呈革兰氏染色阳性，以多个圆形或卵圆形构成的短链形式存在(图1)。将分离菌株分别命名为TJS31。

图1 分离菌株革兰氏染色镜检结果(100×)

2.2 16S rDNA基因鉴定

PCR结果显示，阳性条带大小为1 500 bp(图2)。将PCR产物测序后经Blast比对(图3)，该菌株的16S rDNA序列与GenBank中已发表的猪链球菌序列同源性为99.84%～100.00%。

M.DNA标准DL 2 000；1.TJS31株；2.阳性对照；3.阴性对照

图3 TJS31株16S rDNA核苷酸序列比对结果

2.3 生化特性鉴定

生化试验结果显示，分离菌株可发酵麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、菊糖、棉子糖、七叶苷、淀粉；不发酵甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖，并且触酶试验、MR试验、V-P试验、吲哚试验均为阴性；不能利用甘油、硫化氢、马尿酸盐；在400 mL/L胆汁肉汤和65 g/L高盐肉汤中不生长。

2.4 血清型鉴定结果

2.4.1 玻板凝集试验 试验结果显示，分离菌株与8型SS标准阳性血清出现明显的凝集颗粒(图4)，与其他血清型的标准阳性血清均无凝集现象。

1.生理盐水+TJS31菌液；2.SS 8标准阳性血清+TJS31菌液

2.4.2 PCR鉴定 以SS的不同血清特异性分型引物进行PCR扩增，结果只有SS 8型特异性引物扩增出目的条带(图5)，其他引物均未扩出目的条带，结合平板凝集试验结果，表明该分离株为血清型8型猪链球菌。

M.DNA标准DL 2 000；1.阴性对照；2.TJS31菌株

2.5 药物敏感性试验结果

试验结果显示，TJS31株仅对磺胺间甲氧嘧啶钠敏感，对氨苄西林、头孢曲松钠、卡那霉素中介，对阿莫西林、头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星、强力霉素、林可霉素、庆大霉素、红霉素、氯霉素耐药(表4)。

表3 TJS31株生化试验结果

表4 TJS31菌株的药物敏感性试验结果

2.6 致病力试验结果

4.0×108CFU/mL 感染剂量下，试验组小鼠感染6 h即出现精神萎靡、扎堆现象，24 h内出现死亡，小鼠死亡前表现为呼吸急促，发抖、运动迟缓；在24 h之后，试验期内死亡的小鼠主要表现为不同程度的精神萎靡、被毛粗乱、呼吸急促、眼球混浊等症状；随后，部分小鼠出现一过性神经症状，5 d后小鼠逐渐康复，14 d后部分小鼠留有眼球混浊、头歪等后遗症。对死亡小鼠及时剖检，从心血、肺、肝、脾均能分离培养出大量菌落形态单一的病菌，经染色、镜检为链球菌，PCR方法检测cps8K基因为阳性(图6)，根据改良寇氏法计算，TJS31菌株对昆明小鼠的LD50为1.8×108CFU/mL。

M.DNA标准DL 2 000；1.阴性对照；2.TJS31菌株；3.小鼠体内分离菌株

2.7 毒力基因检测结果

结果显示(图7)，TJS31株携带的毒力基因有sly、gdh、orf2、gapdh。

M.DNA标准DL 2 000；1.orf2；2.sly；3.gapdh；4.gdh；5.阴性对照

表5 TJS31对昆明小鼠的致病力试验结果

3 讨论

近年来，国内学者陆续报道在疑似猪链球菌病例发病猪病料中分离到SS8型，表明该血清型SS在国内的流行呈扩散趋势。同时，有报道表明在健康猪群内也分离到8型SS[16-18]。目前，国内对于SS8型的研究仅停留在流行病学调查阶段，对其携带的毒力基因和致病力相关研究较少。

SS致病性强弱与其携带的毒力基因密切相关，其中cps、mrp、epf和sly是强毒株的标志[19]。国外研究发现，SS2菌株致病性最强的毒力基因型为cps2+/epf+/mrp+/sly+，赵冉对25株SS2国内分离株携带的毒力基因的检测结果显示，96%的菌株表现为cps2+/gdh+/epf+/mrp+/sly+/fbps+/orf2+毒力基因型[20]。迄今，国内尚无关于SS8型携带毒力基因研究的报道。本研究对SS8型天津分离株TJS31携带的毒力基因进行了检测，发现该菌株携带强毒力基因sly，毒力基因型为sly+/gdh+/orf2+/gapdh+。研究结果有助于了解猪链球菌不同血清型菌株之间毒力基因分布差异，为进一步研究这些毒力基因与SS8型致病力的相关性奠定了基础。

应用小鼠感染性试验评价SS致病力强弱的研究很多，陈申申报道SS强毒株对小鼠的LD50处于1×106CFU/mL～1×108CFU/mL区间[21]。WEI等研究SS2型分离菌株对小鼠致病力，认为5×108CFU/mL接种剂量下，引起50%小鼠死亡的菌株为强毒株；3×109CFU/mL接种剂量下50%小鼠死亡的菌株为中等毒力毒株[22]。本研究分离的SS8天津分离株TJS31株对昆明小鼠感染性试验结果表明，TJS31株的LD50为1.8×108CFU/mL，毒力较强。

药敏试验结果显示，TJS31株对13种受试药物中的12种均不敏感，表现为多重耐药特性，值得提高警惕。建议养猪场根据流行菌株的耐药情况，选择敏感的药物用于猪链球菌病的防治，并通过减少抗菌药物的使用量、交替用药等方式，科学合理的使用抗菌药物，遏制病原细菌耐药性的产生。

本研究从临床发病猪中分离、鉴定的8型猪链球菌，具有较强的多重耐药特性，毒力基因型为sly+/gdh+/orf2+/gapdh+。虽然该菌株不携带强致病性毒力基因epf和mrp，但其LD50依然可以达到1.8×108CFU/mL，致病力较强。