清热凉血方对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型JAKs/STATs通路表达影响的研究

齐潇丽 ，李莹 ，蒋俊青 ，白彦萍

（1.天津市中医药研究院附属医院，天津300120；2.山东省煤炭临沂温泉疗养院，山东临沂276032；3.中日友好医院，北京100029）

银屑病是一种T淋巴细胞介导的、免疫反应异常的慢性炎症性皮肤病，以鳞屑性红斑为主要临床表现。目前银屑病的病因及发病机制尚不明确，但研究发现病灶内异常浸润的T淋巴细胞及其产生的炎性因子是银屑病发病的中心环节，活化的信号通路在银屑病的炎性反应和免疫应答过程中发挥着举足轻重的作用，目前研究表明酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子（JAKs/STATs）、Notch、核因子（NF）-κB、细胞外因子（Wnt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路在银屑病的发生发展过程中极为重要，其中，JAKs/STATs通路为近年来的研究热点之一[1]。“清热凉血方”是导师白彦萍教授根据长期的临床经验，在中医基础理论、循证医学及现代药理学的指导下，以犀角地黄汤为底方加减完成的，有清热凉血解毒之功效，是治疗银屑病血热证的代表方。本课题组前期的随机平行对照试验验证了清热凉血方（祛银颗粒）的有效性和安全性[2]，但其具体作用机制尚不明确。本实验以咪喹莫特乳膏诱导建立银屑病样小鼠模型，并以不同浓度清热凉血方干预，以雷公藤多苷作为阳性对照，进而观察清热凉血方对细胞因子信号转导抑制因子（SOCS1）和JAKs/STATs信号通路信号转导因子表达水平的影响，以阐明清热凉血方对银屑病的疗效机制，丰富银屑病中医辨治理论，为中药治疗银屑病临床和科研提供思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 动物 无特定病原体级（SPF）级BALB/c小鼠，雄性，8 周龄，体质量 17～21g，48 只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。于SPF 3级动物房无菌饲料喂养。将咪喹莫特乳膏外涂于BALB/c小鼠背部备皮区，厚度为 1～2 mm，2 次/d，连续 8 d，构建银屑病样小鼠模型。

1.1.2 主要试剂 清热凉血方所含蛇莓、白英、土茯苓、白花蛇舌草、丹皮、生地、赤芍、紫草等购自市售中药房，按照成人剂量换算成小鼠剂量制备水煎剂；咪喹莫特乳膏（忧必青，珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，国药准字h20040283）；雷公藤多苷片（浙江得恩德制药有限公司）；SsoFast EvaGreen Supermix（1725201AP）、引物[英潍捷基（上海）贸易有限公司]、SV Total RNA Isolation System（Z3100）、ReverseTranscriptionSystem（A3500）、Bio-RADiScript cDNA逆转录试剂盒（Z3101）、Trizol溶液（诺华生物）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 将BALB/c小鼠背部去毛后，随机分为正常对照组、模型组、清热凉血方低、中、高浓度组及雷公藤多苷组（阳性药物对照组），用无菌医用棉签将咪喹莫特乳膏均匀涂抹于模型组、清热凉血方组及雷公藤多苷组小鼠背部备皮区域，厚度约为1～2 mm，充分涂抹以使药物被皮肤充分吸收，2次/d，共8 d。与此同时，分别给予雷公藤多苷组、清热凉血方各浓度组小鼠相应溶液灌胃，每只0.1 mL/次，早晚各1次，连续8 d。各组小鼠每天拍照，进行银屑病样皮损严重程度对比，第9天将所有小鼠颈椎脱臼处死后取背部皮肤，分别用于病理组织检测、实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测。

1.2.2 检测指标与方法

1.2.2.1 皮损大体观察 实验期间每天对小鼠进行拍照。参考银屑病皮损面积与严重程度指数（PASI）评分，观察小鼠靶皮损红斑、鳞屑及浸润增厚程度。

1.2.2.2 皮损病理改变 取各组小鼠背部皮肤，经4%甲醛固定、常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋。4 μm厚连续切片，采用苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠靶皮损组织学改变。

1.2.2.3 皮损组织细胞因子mRNA检测 取各组小鼠背部皮肤，采用TRIzol总RNA提取试剂进行样本RNA提取，采用Bio-RAD iScript cDNA逆转录试剂盒进行SOCS1、信号传导与转录激活蛋白3（STAT3）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1、干扰素（IFN）-γ细胞因子的cDNA反转录，用C1000-PCR 仪扩增，扩增条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃5 s，65 ℃ 5 s 30 个循环，采用 2-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析。具体引物序列，见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学分析 用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 清热凉血方对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损作用 在造模过程中肉眼观察各组小鼠一般状况可，未出现感染、死亡等情况，小鼠毛发密度及光泽度未见明显变化；空白组小鼠背部备皮区皮肤光滑，无红肿、鳞屑、糜烂等；模型组小鼠自造模第2天开始在备皮区开始逐渐出现浸润性红斑、厚层银白色鳞屑，少数出现散在出血点，随时间的推移，红斑、鳞屑逐渐加重，直至第8天最为严重；雷公藤多苷组及清热凉血方低、中、高浓度组小鼠备皮区亦出现浸润性红斑、银白色鳞屑，程度均较模型组为轻。其中，清热凉血方低、中、高浓度组小鼠皮损严重程度依次减轻，而雷公藤多甙组小鼠皮损程度与清热凉血方高浓度组小鼠大致相同，见图1。

图1 实验前后各组小鼠皮损变化情况

2.2 各组小鼠靶皮损组织病理变化情况 将各组小鼠靶皮损行常规HE染色，空白组组织学特征表现为角质层为1～3层，棘层细胞3～5层，基底层细胞完整，真皮浅层及血管周围未见明显炎性细胞浸润；模型组及清热凉血方各组小鼠组织病理表现为角化过度伴角化不全，棘层增厚，表皮突下延，真皮浅层淋巴细胞浸润，基本符合银屑病样改变，其程度与肉眼观察结果相符，即清热凉血方低、中、高浓度组小鼠病理严重程度依次减轻，而雷公藤多甙组小鼠病理严重程度与清热凉血方高浓度组小鼠大致相同。见图2。

图2 各组小鼠HE染色病理改变 （HE染色×400）

2.3 各组小鼠靶皮损组织细胞因子PCR变化情况通过实时荧光定量PCR法检测空白组、模型组、雷公藤多甙组、清热凉血方低、中、高浓度组小鼠皮肤组织中 SOCS1、STAT3、TNF-α、IL-6、IL-1、IFN-γ mRNA表达水平差异。结果显示：各指标在模型组皮肤中mRNA表达水平均较空白组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；雷公藤多苷组及清热凉血方不同浓度组各指标mRNA表达水平均较空白组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），较模型组不同程度降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，以清热凉血方高浓度组下降最为明显，其次依次为雷公藤多甙组、中浓度组、低浓度组。见图3～14。

图3 各组SOCS1mRNA相对表达量柱状图

图4 各组SOCS1mRNA相对表达量扩增曲线

图5 各组STAT3 mRNA相对表达量柱状图

图6 各组STAT3 mRNA相对表达量扩增曲线

图7 各组IL-6 mRNA相对表达量柱状图

图8 各组IL-6 mRNA相对表达量扩增曲线

图9 各组TNF-α mRNA相对表达量柱状图

图10 各组TNF-α mRNA相对表达量扩增曲线

图11 各组IL-1 mRNA相对表达量柱状图

图12 各组IL-1 mRNA相对表达量扩增曲线

图13 各组IFN-γ mRNA相对表达量柱状图

图14 各组IFN-γ mRNA相对表达量扩增曲线

3 讨论

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，以鳞屑性红斑为主要临床表现，其病因及发病机制尚未完全阐明，其发生发展可能与细胞因子、信号通路等密切相关。该病顽固难治、极易复发，对患者的生活质量产生极为严重的影响，是皮肤病研究热点之一。

近年来中医中药治疗银屑病的有效性及安全性逐渐被重视。“清热凉血方”是笔者导师白彦萍教授基于中医基础理论，结合银屑病特点、现代药理学及循证医学研究，以“犀角地黄汤”为基础方加减而成的自拟方，有清热凉血解毒作用。本课题组前期的随机平行对照试验验证了清热凉血方（祛银颗粒）的有效性和安全性[2]，采用鼠尾鳞片和鼠阴道上皮模型证实其可通过抑制上皮细胞有丝分裂并促进颗粒层的形成干预银屑病的发生和发展[3-4]，而清热凉血方对银屑病分子机制的作用仍需进一步探究。

近年研究发现，银屑病是与多基因遗传相关的慢性系统性炎症性皮肤病，主要临床表现为鳞屑性红斑。具体病因和病机尚未全部阐明，目前研究认为病灶内异常浸润的T淋巴细胞（CD4+T淋巴细胞为主）是本病发生的中心环节，异常活化的T细胞分泌的细胞因子通过 JAKs/STATs、NF-κB、PI3K/Akt、Notch、Wnt等多条信号通路参与角质形成细胞的过度增殖、异常分化、真皮微血管异常增生等病理过程，从而在银屑病的炎性反应及免疫反应和细胞内信息传递等过程中发挥重要作用。其中，尤以JAKs/STATs通路作用尤为重要。银屑病的发生发展与JAKs/STATs信号通路及相关炎性因子有关，JAKs/STATs通路在银屑病皮损中处于活化状态[5]，而该信号通路受SOCS1的调控[6]，高表达的SOCS1可以抑制JAKs/STATs信号通路及其下游炎性因子的表达[7]，SOCS1可通过影响该通路的活化及调节细胞因子的分泌参与银屑病的发生发展[8]。本实验通过银屑病动物模型，观察清热凉血方对JAKs/STATs信号通路相关因子的影响。

银屑病动物模型的建造方法有很多，目前实验中最常用的为采用咪喹莫特乳膏外用刺激产生银屑病样模型。本实验中模型组小鼠自造模第2天开始于备皮区逐渐出现浸润性红斑、银白色鳞屑，并随时间的推移，症状逐渐加重，部分出现散在出血点，直至第8天时症状最为明显。HE染色观察皮肤组织组织病理学特征，表现为角化过度伴角化不全，棘层肥厚，真皮浅层血管周围淋巴细胞浸润等，基本符合银屑病组织病理学特点，提示造模成功。

为验证清热凉血方对银屑病样小鼠模型的作用，以雷公藤多苷作为阳性对照组，观察不同浓度清热凉血方对小鼠模型的作用，结果发现清热凉血方对银屑病样小鼠模型有治疗作用，这种治疗作用不仅表现为皮损的改善，而且表现在JAKs/STATs信号通路及其相关细胞因子的表达水平变化上；此外，这种改善呈现剂量相关性。模型组小鼠皮肤组织中 STAT3、TNF-α、IL-6、IL-1、IFN-γ 的 mRNA 表达水平与空白组相比呈升高变化，且差异有统计学意义，这在一定程度上符合银屑病的疾病特征。清热凉血方不同浓度组小鼠皮损中细胞因子的mRNA表达水平较模型组不同程度下降，差异有统计学意义；其中清热凉血方高浓度组对其调控水平较雷公藤多甙组更为显著，提示清热凉血方对银屑病样小鼠模型有治疗作用，并且可能通过抑制JAKs/STATs信号通路的表达抑制相关细胞因子的分泌发挥治疗作用。

需要注意的是，本实验结果中雷公藤多苷组及不同浓度清热凉血方组小鼠皮损中SOCS1的表达水平均较模型组下降，这可能与SOCS1受到炎性因子的负反馈调节有关，炎性因子的变化为一个连续的过程，而笔者的检测时间点单一，这也可能是未完全呈现其变化趋势的原因之一。