0＃柴油对大黄鱼早期生活阶段的急性毒性效应

刘守海，张海景，陈耀辉，季 晓，夏利花，何彦龙，秦玉涛，张昊飞

（1.国家海洋局东海环境监测中心，上海 201206；2.自然资源部海洋生态监测与修复技术重点实验室，上海 201206；3.国家海洋局东海海洋环境调查勘察中心，上海 200137；4.上海海洋大学海洋生态与环境学院，上海 201306）

随着海上石油运输量的日益增加，世界油轮进出港口次数也增加，所发生的船舶溢油事故是主要的石油突发性输入来源，据统计，我国进口的石油90%依靠海上船舶运输完成，每年发生的各类船舶溢油事故超过500起，随着沿岸港口油轮密度增加，发生石油污染事故的风险也不断增大［1］。溢油事故频繁发生，会给渔业、养殖业等产业带来巨大损失，同时也使得海洋环境受到严重污染，给海洋生态资源造成巨大损害［2-4］。石油烃能够通过呼吸、摄食等途径进入生物体并在组织内积累，造成细胞DNA损伤，降低酶的活性、影响生物的发育等［5-9］。低浓度石油长期的亚急性毒性可干扰其繁殖和摄食，高浓度石油会使鱼卵和仔幼鱼在短时间内大量死亡［10-12］。漂浮在海面的油膜易黏附在鱼卵和仔、稚鱼表面，使鱼卵不能正常孵化，仔、稚鱼丧失或减弱活动能力，影响其正常生理功能，有的甚至死亡。海水中石油烃水溶性成分对鱼卵和仔、稚鱼的危害主要通过表皮侵入体内，影响海洋生物早期发育阶段的神经中枢和呼吸器官［13-15］，因此鱼卵和仔、稚鱼对石油类的毒性十分敏感［15-17］。李磊等［15］研究了0＃柴油和原油水溶性成分（water accommodated fraction，WAF）对 黑 鲷（Sparus macrocephlus）肝脏7-乙氧基异吩噁唑酮-脱乙基酶（EROD）活性及细胞色素P4501A1（CYP1A1）mRNA表达量的影响。李磊等［18］应用半静态双箱动力学模型在室内模拟了黑鲷对0＃柴油和东海平湖原油水溶性成分（WAF）的生物富集实验。李传慧等［8］研究了不同浓度胜利原油暴露1、2、4、8、15 d以及解除污染1 d和3 d后对半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）幼鱼肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和谷胱甘肽转硫酶（GST）活性的影响。吕福荣等［19］研究了0＃柴油、船用柴油和船用重质燃料油分散液（WAF）对马粪海胆（Hemicentrotuspulcherrimus）卵细胞、精子及胚胎发育的毒性效应，并通过色谱-质谱对3种油品分散液进行了组分分析。上述学者在石油中的原油、汽油、柴油等对海洋生物的影响方面都做了较为详实的研究报道，但不同油品成分不同，对海洋生物的毒性效应也不尽相同。

本项目以东海海域常见的经济鱼类——大黄鱼（Larimichthyscrocea）为研究对象，在0＃柴油水溶性成分暴露胁迫下进行急性毒性实验，获得0＃柴油对大黄鱼的急性毒性效应；建立剂量-时间-效应关系，解析大黄鱼对0＃柴油胁迫的生理响应特征，以期为0＃柴油海洋生态污染的风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用海水从自然海区抽取，盐度为21，pH为8.1，进行沉淀和砂滤，充分曝气（24 h以上）后备用。实验对象来自江苏省海洋水产研究所大黄鱼育苗场，大黄鱼鱼卵为亲鱼（体长约为40 cm）的自然排卵，仔鱼由鱼卵直接培养孵化，为刚孵化3 d未开口的仔鱼和孵化10 d开口仔鱼，幼鱼为育苗场自然生长的大黄鱼，平均体长为（3.89±1.12）cm，平均体质量为（3.01±1.05）g。实验用油为中石化加油站售的0＃柴油。

1.2 实验母液的制备

将0＃柴油与沙滤海水按1∶10（V∶V）配比，置于磁力搅拌机上，连续高速搅拌24 h后静置3 h分离出水相［20］，注入水溶分（WAF）母液贮存瓶中，母液置于冰箱4℃保存。采用紫外分光光度法测定母液中的总石油烃浓度，即为柴油水溶性成分，为了更准确地反映真实浓度，用0＃柴油作为其标准油。

1.3 实验方法

1.3.1 大黄鱼鱼卵、初孵仔鱼、仔鱼

鱼卵、初孵仔鱼实验容器采用自制实验装置［9］，主体为6孔的细胞培养板，每个实验容器分隔6个实验圆形槽，上层有密封盖，每个槽对应密封盖中间有一个小孔。在每个实验容器中分别投入约60个未孵化的受精卵（高囊胚期，卵径为0.9 mm）、48尾初孵3 d仔鱼（体长约为1 mm）和48尾孵化10 d仔鱼（体长约为7 mm）。

参照《化学品鱼类胚胎和卵黄囊仔鱼阶段的短期毒性试验》（GB 21807-2008）方法，进行静态毒性实验。控制实验温度为（18±2）℃，pH为8.1，实验用水溶解氧高于6 mg·L-1。采用静态法进行孵化实验，间隔24 h换100%同等浓度的溶液。每间隔24 h用显微镜进行观察，记录实验期间胚胎的死亡率（卵发白不透明或卵膜内物质凝聚为一白色的小点）、孵化率（破膜而出）、形态畸形率（脊椎畸形、尾椎弯曲等），剔除已经死亡的受精卵。当用显微镜观察到对照组鱼卵破膜仔鱼时实验结束。根据预实验，设置柴油水溶性成分在大黄鱼鱼卵中的5个实验浓度：7.52、3.37、1.52、0.68、0.31 mg·L-1；初孵仔鱼（3 d）设置5个实验浓度：4.80、2.40、1.20、0.60、0.30 mg·L-1；初孵仔鱼（10 d）设置5个实验浓度：7.20、3.60、1.80、0.90、0.45 mg·L-1；同时以自然海水为对照组，每个浓度组设3个平行样。使用0＃柴油水溶性成分母液和实验海水按照配比获得相对应的实验浓度。

1.3.2 大黄鱼幼鱼

以自行设计定制的30 L密封玻璃缸为容器，每个容器上部用玻璃板遮盖密封，防止石油挥发，玻璃缸体中有一个小的缸体，放置一些过氧化钠作为氧气再生剂，为幼鱼提供氧气。在每个玻璃缸体中投入40尾幼鱼［平均体长为（4.5±0.3）cm，平均体质量为（1.89±0.27）g］。控制实验温度为（18±2）℃，pH为8.1，实验用水溶解氧高于6mg·L-1。根据预实验设置5个浓度组：9.80、5.20、2.80、1.50、0.80 mg·L-1，同时以自然海水为对照组，每个浓度组设3个平行样。采用静态法进行96 h实验，每间隔24 h换100%同等浓度的溶液。观察和统计24、48、72、96 h出现的死亡个体数。

1.4 数据处理

参照《GB 17378.7-2007》第7部分“近海污染生态调查和生物监测规定”中半致死浓度（LC50）的计算方法。采用概率单位算法，求得回归方程并进行可靠性检验，计算96 h半致死浓度LC50及95%置信区间。根据《化学品鱼类胚胎和卵黄囊仔鱼阶段的短期毒性试验》（GB 21807-2008）中的公式SC＝96 h LC50×0.1，推算出安全浓度。

2 结果与分析

2.1 0＃柴油水溶性成分对大黄鱼鱼卵和初孵仔鱼的毒性效应

2.1.1 鱼卵的孵化率

大黄鱼鱼卵的孵化率随着0＃柴油水溶性成分暴露浓度的升高而逐渐下降，孵化率最低仅有15.40%（7.52 mg·L-1暴露浓度）。0＃柴油水溶性成分浓度对鱼卵孵化率显示出显著的负相关关系，两者的剂量反应曲线为y＝-19.2lnx＋57.06（图1）。

2.1.2 初孵仔鱼的致畸率

随着0＃柴油水溶性成分暴露浓度的升高，大黄鱼初孵仔鱼的致畸率逐渐上升，致畸率最高为35.23%（7.52 mg·L-1暴露浓度）。0＃柴油水溶性成分浓度对初孵仔鱼的致畸率显示出显著的正相关关系，两者的剂量反应曲线为y＝4.264x＋4.216（图2）。

图1 0＃柴油水溶分对大黄鱼鱼卵孵化率的影响曲线Fig.1 Hatching rate of fish eggs of L.crocea in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

图2 0＃柴油水溶性成分对大黄鱼初孵仔鱼致畸率的影响曲线Fig.2 Teratogenic rate of L.crocea larvae in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

2.2 0＃柴油水溶性成分对大黄鱼初孵仔鱼（3 d）的96 h急性毒性效应

统计结果显示，0＃柴油水溶性成分浓度与初孵仔鱼（3 d）的死亡率之间显示出显著的正相关关系（图3），两者的剂量反应曲线为y＝16.29x＋20.45，半致死浓度（96 h LC50）为1.00 mg·L-1，安全浓度为0.10 mg·L-1（表1）。

图3 0＃柴油水溶性成分对大黄鱼仔鱼（3 d）的96 h死亡率Fig.3 96 h mortality rate of L.crocea larvae（3d）in water accomm odated fractions of No.0 diesel fuel

表1 0＃柴油水溶性成分对大黄鱼仔鱼和幼鱼的急性毒性效应Tab.1 Acute toxic effect of L.crocea larvae and young in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

2.3 0＃柴油水溶性成分对大黄鱼仔鱼（10 d）的96 h急性毒性效应

统计结果显示，0＃柴油水溶性成分浓度与仔鱼（10 d）的死亡率之间显示出显著的正相关关系（图4），两者的剂量反应曲线为y＝23.67x-15.72，半致死浓度（96 h LC50）为1.07 mg·L-1，安全浓度为0.11 mg·L-1（表1）。

图4 0＃柴油水溶性成分对大黄鱼仔鱼（10 d）的96 h死亡率Fig.4 96 h mortality rate of L.crocea larvae（10 d）in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

2.4 0＃柴油水溶性成分对大黄鱼幼鱼的96 h急性毒性效应

统计结果显示，0＃柴油水溶性成分浓度与幼鱼的死亡率之间显示出显著的正相关关系（图5），两者的剂量反应曲线为y＝25.28x-20.38，半致死浓度（96 h LC50）为2.02 mg·L-1，安全浓度为0.20 mg·L-1（表1）。

图5 0＃柴油对大黄鱼幼鱼的96 h死亡率Fig.5 96 h mortality rate of L.crocea young in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

3 讨论

石油类的生物毒性效应与其所含的低分子量烷烃和芳香烃的组成及绝对含量有密切关系［21］。0＃柴油的饱和烷烃和芳香烃分别约占总组分的65%～70%和20%～30%［20］，且芳香烃含量越高的油类对生物的毒性越大［22］。水生生物孵化失败和发育迟缓是石油类污染物的主要毒性效应之一［23］。研究表明，石油烃对鱼胚胎发育有影响，孵出仔鱼多为畸形且在孵化后死亡［24-25］，主要表现在有机物进入胚胎，毒性会干扰胚胎的正常发育，或阻滞鱼卵的孵化从而延长孵出时间，或使孵出的仔鱼畸形，严重的会导致胚体死亡［26-27］。本研究中，随着海水中0＃柴油水溶性成分浓度的升高，大黄鱼鱼卵的孵化率明显下降，且在浓度为0～3.37 mg·L-1下降得最快。石油污染对鱼类的神经系统、呼吸系统等有一定的影响。体表皮肤渗透或者呼吸器官呼吸等作用，是石油类WAF在生物体内被动吸收并富集于体内的主要途径［9，28-29］。贾晓平等［30］利用南海原油、0＃柴油和20＃柴油对不同鱼类进行实验，通过镜检发现，不同浓度组仔鱼的鳃部不同程度的分布着散性油滴，阻碍了仔鱼的正常呼吸。另外，多个研究发现，石油类污染物会使鱼类体内酶的活性发生变化，从而导致机体自身代谢和自我调节发生紊乱［5，31］。本研究使用0＃柴油水溶性成分对不同阶段的大黄鱼进行了96 h急性毒性效应实验，结果显示，大黄鱼初孵仔鱼（3 d）、大黄鱼仔鱼（10 d）和大黄鱼幼鱼的安全浓度分别为0.10、0.11、0.20 mg·L-1；半致死浓度分别为大黄鱼幼鱼（2.02 mg·L-1）＞仔鱼（10 d）（1.07 mg·L-1）＞初孵仔鱼（3 d）（1.00 mg·L-1）。由此可推断，仔鱼阶段对0＃柴油水溶性成分的毒性比幼鱼阶段更为敏感，表明随着大黄鱼的生长发育，其对0＃柴油的耐受性也有一定增强。