肠道气泡堆积对银鲳组织抗氧化能力与溶菌酶活力的影响

郑 迪，王 倩，王 磊，施兆鸿，彭士明

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

银鲳（Pampus argenteus）属鲈形目（Perciformes），鲳科（Stromateidae），鲳属，因其肉质细嫩、肌间刺较少，营养丰富，具有较高的市场价值与需求，是我国主要的海产经济鱼类之一［1］。20世纪80年代，国内已陆续开展银鲳繁殖生物学方面的研究工作［2］，截至目前，已取得银鲳的人工繁育［3］、人工育苗［4］等方面研究成果，并于2016年在宁波地区实现人工养殖银鲳亲鱼近万尾［5］，但目前关于疾病方面的研究较少。由于驯化时间较短、银鲳环境适应能力较差等原因导致的病害问题，是制约银鲳规模养殖和推广的主要因素之一。

早在20世纪初，科威特就报道了某银鲳养殖基地由于无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）感染引起的大规模死亡现象［6］，2015—2018年宁波象山地区银鲳养殖基地先后爆发了由美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae）感染导致的集体出血［7］和彩虹病毒感染导致的集中死亡现象［8］。此前研究所发现的均为细菌性或病毒性疾病，尚未见银鲳肠道气泡堆积相关的报道。肠道气泡堆积是银鲳养殖过程中一种常见的病理现象，从仔稚幼鱼到高龄成鱼都有可能发生，且该病发生在肠道内部，难以发现和控制［9］，在养殖过程中致死率较高。本文通过对患有肠道气泡堆积的银鲳及健康银鲳体内的4种组织（肝脏、肾脏、肌肉、鳃）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力、丙二醛（malondiadehyde，MDA）含量与总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC），以及两种组织（鳃、肾脏）溶菌酶（lysozyme，LZM）活力的测定和比较，分析肠道气泡堆积对银鲳组织抗氧化能力和溶菌酶活力的影响，以期为该病理现象的防治提供数据支持，促进银鲳养殖业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本实验用银鲳采自东海水产研究所福鼎研究中心工厂化养殖车间，该车间拥有4个银鲳养殖池，养殖水体20 m3，每个养殖池均采用相同的日常管理措施：每天饱食投喂2次（7∶00和16∶00），日换水量50%，水温20～22℃，盐度25～27，pH为8.1～8.2，溶解氧保持在7 mg·L-1。在管理过程中注意观察鱼的游动行为，对行为异常如游动速度加快［10］、垂直或水平停在水面［11］、躁动不安、对惊吓敏感甚至跳出水面［9］等疑似肠道气泡堆积的银鲳进行采集，捞起后于25 mg·L-1丁香酚中麻醉，冰盘解剖，肉眼观察其肠道内是否有明显的气泡堆积，如有则可确认其为所需要的病鱼样品（图1）。取其肝脏、肾脏、肌肉和鳃在预冷的生理盐水中漂洗后，滤纸拭干，液氮速冻后于-80℃保存，待样品全部采集完成后带回实验室统一测定。病鱼取15尾为有气泡组，平均叉长为（11.7±0.8）cm，平均体质量为（42.8±4.1）g。另选摄食、游动等行为正常，有活力、游动有规律且解剖观察肠道无气泡堆积的健康鱼15尾为对照组，平均叉长为（12.5±0.7）cm，平均体质量为（48.6±5.6）g。两组样品取样方法一致。

图1 病鱼的肠道气泡堆积Fig.1 Intestinal bubble accumulation in diseased Pampus argenteus

1.2 酶活力测定

银鲳的肝脏、肾脏、肌肉和鳃组织中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，T-AOC、CAT、SOD和LZM活力、MDA含量的测定均严格按照南京建成生物公司检测试剂盒说明书进行操作。随机取3尾鱼的样品组织混为一个样品进行检测，对照组与病鱼组每个组织分别检测5次，每次检测3个重复，取平均值。

1.3 数据处理

所得数据以平均值±标准差（means±SD）表示，实验结果采用SPSS19.0进行统计分析，并进行独立样本t检验，分析各组间相关参数差异显著性，并使用Excel 2010作图。

2 结果与分析

2.1 肠道气泡堆积对银鲳4种组织中T-AOC活力的影响

肠道气泡堆积对银鲳4种组织T-AOC活力的影响见图2，相比对照组，病鱼组肝脏、鳃和肾脏中T-AOC活力都有下降，其中肝脏和肾脏下降显著（P＜0.05）；但病鱼组肌肉中T-AOC活力显著高于对照组（P＜0.05）。

图2 肠道气泡堆积对银鲳4种组织中T-AOC活力的影响Fig.2 Effect of intestinal bubble accumulation on T-AOC activity in 4 tissues of Pampus argenteus

2.2 肠道气泡堆积对银鲳4种组织中SOD活力的影响

肠道气泡堆积对银鲳4种组织SOD活力的影响见图3，肝脏中SOD活力高于其他各组织；对照组肝脏和肌肉中SOD活力显著高于病鱼组（P＜0.05），而在鳃和肾脏SOD活力在病鱼组与对照组间没有显著差异（P＞0.05）。

图3 肠道气泡堆积对银鲳4种组织中SOD活力的影响Fig.3 Effect of intestinal bubble accumulation on SOD activity in 4 tissues of Pampus argenteus

2.3 肠道气泡堆积对银鲳4种组织中CAT活力的影响

肠道气泡堆积对银鲳4种组织CAT活力的影响见图4，肝脏中CAT活力高于其他组织；对照组肝脏和肌肉中CAT活力显著高于病鱼组（P＜0.05），而在鳃和肾脏中没有显著差异（P＞0.05）。

2.4 肠道气泡堆积对银鲳4种组织中MDA含量的影响

肠道气泡堆积对银鲳4种组织MDA含量的影响见图5，病鱼组肝脏和肌肉中MDA含量显著高于对照组（P＜0.05），但鳃和肾脏中MDA含量显著低于对照组（P＜0.05）。

图4 肠道气泡堆积对银鲳4种组织中CAT活力的影响Fig.4 Effect of intestinal bubble accumulation on CAT activity in 4 tissues of Pampus argenteus

图5 肠道气泡堆积对银鲳四种组织中MDA含量的影响Fig.5 Effect of intestinal air bubble accumulation on MDA content in various tissues of Pampus argenteus

2.5 肠道气泡堆积对银鲳两种组织中LZM活力的影响

肠道气泡堆积对银鲳两种组织LZM活力的影响见图6，病鱼组鳃上LZM活力显著高于对照组（P＜0.05），而在肾脏中没有显著差异（P＞0.05）。

图6 肠道气泡堆积对银鲳两种组织中LZM活力的影响Fig.6 Effect of intestinal bubble accumulation on LZM activity in 2 tissues of Pampus argenteus

3 讨论

目前对于鱼类肠道气泡堆积的研究还不深入，肠道内大气泡的形成是来自各组织以及血管的微气泡汇集，通常在显微镜下便可观察到微气泡的移动和汇集［12］。微气泡最初如何形成尚待研究，但这些微气泡的移动和汇集会引起组织损伤并随之导致自由基的增多，而过量的自由基则会破坏宿主细胞［13］。在长期进化过程中，鱼类机体形成了一套抗氧化酶防御系统，主要包括CAT、SOD等，可以有效地将机体多余的自由基清除，保护机体免受氧化损伤［14］。

3.1 肠道气泡堆积对银鲳4种组织抗氧化酶活力的影响

总抗氧化能力是评价机体抗氧化酶系统和非酶促系统功能的综合性指标［15］，可以反映机体抗氧化防御系统的状态。已有研究表明，病害的发生会显著降低水产动物抗氧化酶活力，如患水霉病鲤（Cyprinuscarpio）与健康鲤相比，血浆总抗氧化能力极显著降低［16］；陈萍等［17］用溶藻弧菌感染三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）后发现其抗氧化能力显著降低。本研究中，病鱼组肝脏和肾脏T-AOC活力下降显著，说明肠道气泡堆积会导致银鲳部分组织T-AOC活力降低，造成鱼体抗氧化系统紊乱。

SOD和CAT是清除活性氧自由基的重要酶蛋白，对机体细胞损伤后的氧化过程和吞噬作用具有很强的防御功能，通常认为：SOD在清除活性氧的过程中最早发挥作用，它首先促使O2-歧化为H2O2和H2O，随后CAT再将H2O2催化为H2O和O2，从而达到为机体解毒的目的［18］。在本实验中，患有肠道气泡堆积的银鲳鳃和肾脏中的SOD、CAT活力和健康银鲳没有显著差异，但肝脏和肌肉中的SOD、CAT活力显著低于健康银鲳，说明就抗氧化酶系统而言，肠道气泡堆积对银鲳肝脏和肌肉的影响较大，对鳃和肾脏影响相对较小，这在陈寅儿等［19］对三疣梭子蟹乳化病的研究中也有类似结论。对于肌肉中T-AOC活力的显著上升，而SOD、CAT活力显著下降现象，其原因可能是鱼体在肠道气泡堆积发生情况下的一种机体自我保护机制，具体原因需要进一步的研究确定。

MDA是一种高活力的脂质过氧化产物，既可用作脂质过氧化程度的衡量指标，也可间接反映机体内活性氧的累计［20］，该指标常与SOD和CAT活力指标相互配合使用［21］。在本实验中，患病银鲳的肝脏和肌肉中的MDA含量显著高于健康银鲳，说明这两处组织已出现自由基的代谢紊乱，而过多自由基的产生以及自由基清除酶的活力降低或合成障碍，使得自由基进一步堆积，加剧损害，这与前文CAT和SOD活力研究相符合。另外，本实验选取病鱼样品为肠道内已有大气泡聚集，即发病后期，气泡在鱼体内移动，汇集期间产生的组织损伤或许是导致这两处组织MDA含量异常的原因之一。对于在鳃和肾脏中，患病银鲳MDA含量显著低于健康银鲳，其原因可能在肠道气泡堆积发生期间，这两处组织应对其病理发生的机制与肝脏和肌肉组织有所差异［22］，具体原因仍需进一步研究分析。

3.2 肠道气泡堆积对银鲳两种组织溶菌酶活力的影响

LZM是白细胞中一类先天免疫防御成分，它通过水解细胞壁中的肽聚糖来杀灭细菌［23］，其活性一定程度上可以反映机体抵御细菌侵袭的能力［24］。在本实验中，患病银鲳肾脏LZM活力与健康银鲳没有显著差异，但鳃上LZM活力显著高于健康银鲳。肠道气泡堆积的发生极易造成组织损伤，从而导致各种致病微生物继发感染，其中尤以细菌和真菌最多见［12］，所以患病鱼鳃上很有可能出现细菌感染，从而激发了鳃上溶菌酶免疫应答体系，使得LZM的活力显著升高，但具体原因仍有待进一步分析确定。另外，在理化和生物因子异常引起的胁迫情况下，LZM活力也可以作为鱼类应激程度的指示信号［25］。有研究显示，当水体中悬浮物过多时，半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevisGünther）肝脏中LZM活力在5d内显著升高［26］。华 育 平 等［27］发 现 嗜 水 气 单 胞 菌（Aeromonashydrophila）感染后的施氏鲟（Acipenser schrenckii）血清及各组织中LZM出现不同程度升高。在本实验中，当肠道气泡堆积发生时，微气泡从组织和血管移动到肠道汇集成大气泡，而鳃作为鱼类呼吸器官，同时也是微血管最密集的体组织之一，有可能处于应激状态，但仍需其他指标进行佐证。

4 小结

本实验通过对患有肠道气泡堆积的银鲳及健康银鲳体内4种组织（肝脏，肾脏、肌肉和鳃）SOD、CAT、T-AOC活力、MDA含量以及两种组织（鳃和肾脏）LZM的测定和比较，发现该病对鱼类肝脏、肌肉抗氧化酶活力影响较大，这两种组织的抗氧化酶活力指标或可以成为该病检测和病理分析的重要依据之一，而肠道气泡堆积导致的鳃溶菌酶活力升高，可能是肠道气泡堆积发生期间伴随着鳃组织炎症的发生，具体原因仍待进一步深入研究分析。