脱细胞猪小肠黏膜下层粉末用于大鼠脾部分切除创面止血的研究

王文平，张文红，杜茂涛，张弘沛，龚 慧，朱宇轩，李世荣，田 怡

(1.重庆医科大学附属第二医院整形美容科，重庆 400010;2.陆军军医大学第一附属医院整形美容科，重庆 400038)

快速有效的止血方法在创伤急救和外科手术中都非常重要。除了常规止血方法(压迫止血、结扎止血、电凝止血)，局部外用止血药物也提供了新的止血策略。局部外用止血药物按照其凝血机制可分为两大类：一类是接触后主动启动生物体内凝血级联反应形成纤维蛋白凝块产生凝血作用；另一类是通过接触、活化促进血小板聚集而产生被动凝血作用[1]。局部外用止血药物已广泛应用于整形外科、泌尿外科、神经外科等领域，减少了医疗资源和血液制品的浪费[2-6]。

理想的止血材料应具备以下特征：止血迅速，具有生物相容性及可降解性，无细胞毒性，无免疫原性，不增加感染概率，不影响组织愈合，易于消毒，成本低且易于获得[7]。目前使用的局部止血药物有多种类型，如纤维素类、纤维蛋白、凝血酶、壳聚糖、明胶海绵类，但都各有利弊。因此，迫切需要开发易于获取、安全、有效、实用和低成本的新型止血材料。

脱细胞猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)是异种来源、不含细胞成分、生物相容性好、在体内可降解的生物材料。SIS主要是由胶原、糖胺聚糖构成，富含生长因子，已成功用于多种临床治疗，包括硬脑膜移植、疝气修复、腹壁重建以及肾肿瘤肾部分切除术后的尿漏及创面出血[8]。鉴于SIS的优点及广泛运用，本研究将脱细胞处理的SIS经冻干后粉碎制成粉末，用于大鼠脾部分切除创面止血，以观察其止血效果。

1 材料与方法

1.1 脱细胞SIS粉末制备[9]

取新鲜猪小肠，用刮匙刮除浆膜层和肌层获得黏膜下层，清洗后用甲醇和氯仿(体积比1∶1)浸泡12 h脱脂；去离子水漂洗3次后，用0.05%胰酶、0.05%EDTA室温下消化12 h脱细胞；去离子水冲洗3次，于含0.5%SDS的生理盐水中振荡4 h，生理盐水冲洗3次；0.5%醋酸浸泡过夜，打浆机粉碎后加入胃蛋白酶，室温下酶解2 d后过滤；滤液经2次盐析离心后取沉淀，将沉淀溶解于0.1%醋酸中，8KD透析袋透析24 h；透析后的液体经冷冻干燥机冻干后粉碎成粉末(图1)，消毒后保存于无菌容器内，4 ℃冰箱密闭保存。

1.2 SIS的DNA残留及SIS粉末吸水性检测

冻干处理的SIS膜进行HE染色，以观察脱细胞后的细胞残留情况。称重并记录筛网的重量(筛孔大小200目)为M0；将SIS粉末(0.5 g)放入筛网中，然后浸入水槽，在不同的时间点(5 s、10 s、15 s、20 s、40 s、60 s、120 s)从水中取出筛网，纱布吸出残留水分后称重，记为Mt。同样方法检测福和泰止血粉(青岛颐中生物工程有限公司)、瞬时止血粉(山东赛克赛斯药业科技有限公司)的吸水率作为对照。吸水率=(Mt-M0-0.5)/0.5×100%。

a:脱细胞脱脂冻干等处理后的SIS;b:机械粉碎后获得的SIS粉末

1.3 大鼠脾部分切除创面的止血

将40只健康成年SD大鼠随机分为A组(SIS粉末)、B组(福和泰止血粉)、C组(瞬时止血粉)、D组(无菌纱布压迫)，每组10只。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉，仰卧固定在动物手术台上，碘伏消毒后切开腹部，将脾完全暴露，纱布吸出腹腔和脾表面的液体，在脾末端沿短轴方向，用剪刀剪去约0.5 cm的脾组织，纱布清除表面流血，建立脾出血模型[10]。按照分组将止血粉末喷于创面，然后将脾置于无菌纱布上，观察伤口的出血情况，直到出血停止；D组用无菌纱布压迫直到出血停止。记录出血时间和出血量(脾放置在纱布前后的重量差)。5-0尼龙线缝合腹部切口，并用抗生素药膏保护其免受感染。

1.4 扫描电镜观察止血粉及其用于创面后的结构

3种止血材料用于创面10 min后，取下带有止血材料的脾组织置于戊二醛固定24 h，经过洗涤、脱水、喷金等处理后在扫描电镜下观察其表面以及在脾表面的超微结构。

1.5 使用止血粉后脾创面组织学观察

术后第20天、30天，每组处死5只大鼠。切开腹部，观察止血粉在脾创面上的吸收情况。然后将组织取下用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋并切片进行HE染色。在光学显微镜下观察脾的创面情况。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 脱细胞后SIS细胞残留及吸水性检测

HE染色结果显示脱细胞处理后SIS中无细胞成分残留(图2a)。SIS粉末、福和泰止血粉和瞬时止血粉均具有很强的吸水能力。福和泰止血粉与水接触后迅速溶解形成凝胶状牢固地黏附在筛板上，不再吸收水分;瞬时止血粉在前10 s内迅速吸水，在15 s时，吸水率达到饱和(1 176.87±47.21)%;SIS粉末的吸水性在前10 s内弱于瞬时止血粉，在15 s时已具备和瞬时止血粉相同的吸水率，并在120 s时达到饱和(2 289.18±26.46)%，是瞬时止血粉的1.87倍;重量相同的3种粉末，SIS粉末的吸水率显著高于福和泰止血粉和瞬时止血粉(图2b)。

2.2 使用止血粉后创面情况

A组SIS粉末喷洒在出血创面上，逐渐从血液中吸收水分并浓缩血液中的固体成分(血小板、红细胞、凝血因子和纤维蛋白)，SIS粉末相互接触形成机械屏障封闭创面，出血逐渐停止，止血效果彻底；B组福和泰止血粉喷在出血创面后立即溶解，形成牢固的凝胶状薄膜黏附在创面上，出血逐渐停止；C组瞬时止血粉与B组相似；D组压迫5 min后，伤口仍有少量出血，用纱布持续压迫伤口后，血流量逐渐减少，最终出血停止。第20天时，A、B、C组创面均可看到未吸收完的止血粉末；第30天时，创面上的止血粉末较第20天时明显减少，福和泰止血粉基本已完全被吸收完，SIS粉末的吸收较福和泰止血粉、瞬时止血粉慢(图3)。

a:SIS脱细胞处理后HE染色;b:3种止血粉末的吸水率比较 *：与SIS粉末比较，P<0.01

图3 止血粉末用于创面当时及第20天、30天的止血情况(红色箭头所示为未吸收的止血粉末)

2.3 出血时间及出血量

A组、B组和C组的出血时间和出血量均短/少于D组，A组的出血时间和出血量短/少于C组，A组的出血时间短于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.4 扫描电镜结果

镜下见SIS粉末呈单层的长薄片状，福和泰止血粉呈细长的纤维状，瞬时止血粉呈大小不均的圆球状(图4)。脾凝血块样品镜下见SIS粉末相互接触形成膜状的机械屏障，同时血液中的成分(如凝血因子、血小板、纤维蛋白和红细胞)聚集在SIS的表面上，加速了内源性凝血机制。

表1 各组出血时间及出血量比较

2.5 使用止血粉后脾组织的一般观察和组织学评价

A组第20天时可观察到相对多的SIS粉末，第30天时创面上SIS粉末逐渐减少，明显少于第20天时；B组大部分止血粉在第20天被吸收，在第30天基本被完全吸收；C组第20天时可见大量未吸收完的止血粉末，第30天时创面可见少量未吸收的止血粉末，见图5。

a～c：3种止血粉末的结构；d～f：3种止血粉末在创面上参与止血时的结构

图5 HE染色观察止血粉末的吸收情况(黑色箭头所示为未吸收完的止血粉末)

3 讨论

在外科手术过程中，毛细血管或小静脉弥漫性、持续性的出血会引起很多问题，术中使用高效的局部止血剂能够保持手术视野清晰，减少输血，缩短手术时间，降低并发症的发生率等[11-12]。优质的止血药物在外科手术中起着关键作用，目前可供选择的局部止血剂有多种类型，如纤维素类、纤维蛋白、凝血酶、明胶海绵类等。其中纤维素类(如复合微孔多聚糖蛋白)的止血效果非常好，但由于其成本较高，临床应用受限；纤维蛋白和凝血酶有可能引起免疫反应和输血传播性疾病；动物来源的胶原蛋白，尤其是牛来源的胶原蛋白，容易产生免疫反应；明胶海绵类止血药物有导致脓肿和肉芽肿的风险。目前国内可吸收止血材料行业相对来说基础薄弱，技术研发能力偏低，产品质量较低，与国外差距大，且止血材料研究领域落后于其他医学领域，很少有重大进展，临床所用多为经典材料。因此，急需开发易于获取、安全、有效、体内可降解、实用和低成本的止血材料。

本研究探索了SIS粉末作为止血材料应用于大鼠脾部分切除创面止血的情况，结果显示，经过脱细胞处理后的SIS膜不含有细胞成分，无DNA残留，不会引起免疫反应。另外，由于止血剂长时间黏附于创面会引起组织炎症反应，而本研究组织学检测结果显示，SIS粉末、福和泰止血粉和瞬时止血粉都可以在1个月左右降解完。说明脱细胞SIS粉末对机体来说是比较安全可靠的。

本研究吸水性能检测结果显示，福和泰止血粉吸水后形成凝胶状，吸水性能有限；瞬时止血粉吸水迅速；SIS粉末的吸水性在15 s时可达到与瞬时止血粉相同的吸水率，随后还能继续吸水，最大吸水率是瞬时止血粉的1.87倍。扫描电镜结果显示SIS粉末的止血机制与瞬时止血粉相似。SIS粉末喷洒到创面后相互连接形成一个膜状的机械屏障，同时迅速吸收血液中的液体成分，浓缩血液中的血小板、红细胞、凝血因子、纤维蛋白，启动内外源性凝血过程，加速凝血。相比于福和泰止血粉和瞬时止血粉，SIS粉末的止血效果更佳，更具优势。

SIS是异种来源的生物材料，经过加工处理后去除细胞成分，在生物体内具有良好的生物相容性，并且可以在体内降解，已成功用于许多临床治疗。但是也有研究指出，在处理过程中若DNA不能完全去除时会引起机体的免疫反应。因此，在进行脱脂脱细胞处理时可以适当延长处理时间并反复漂洗，尽量去除DNA。本研究也存在一定的局限性，只在大鼠脾出血进行止血研究，未在大型动物创面或脏器出血进一步研究以模拟人体出血止血情况，对于SIS粉末的止血效果及止血的具体机制还需要进一步的研究。

综上，SIS粉末在体内可降解，具有极强的吸水性。SIS粉末作为止血剂，在大鼠脾部分切除创面具有良好的止血作用，应用前景广阔。