MiR-506-3p在肾透明细胞癌中作用的生物信息学分析

周凯，苏琪盛，黎承杨

(广西医科大学第一附属医院 泌尿外科，广西 南宁 530021)

0 引言

肾透明细胞癌是成年人最常见的一种肾脏肿瘤，是来源于肾脏泌尿小管上皮系统的一种恶性肿瘤，大概占到所有肾肿瘤的大约75%[1]。目前有大量研究表明，microRNA(miRNA)在肾透明细胞癌的发生发展中起着重要的作用[2-4]。

miR-506-3p肾透明细胞癌中低表达，其低表达与晚期临床分期和预后不良有关，并通过直接靶向肾癌中的FLOT1发挥其抗癌功能[5]，然而miR-506-3p在肾透明细胞癌中的作用仍有待进一步探究。本文采用生物信息学手段，对miR-506-3p 在肾透明细胞癌中的作用进行探究，以期为后期深入研究miR-506-3p 在肾透明细胞癌中的作用及其机制提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 Starbase工具分析miR-506-3p在肾透明细胞癌表达

Starbase v3.0是一款由Qu Lab. School of Life Science，Sun Yat-sen University开发的一个开源平台，可以分析CLIP-seq、ome-seq和RNA-RNA间质数据研究miRNAncRNA、miRNA-mRNA、ncRNA-RNA、RBP-ncRNA和RBPmRNA相互作用[6]。我们通过starbase中的starBase Pan-Cancer Analysis Platform平台工具分析TCGA数据库中hasmiR-506-3p在肾透明细胞癌中的表达。

1.2 GEO2R分析肾透明细胞癌中上调的差异基因

在GEO数据库GEO Dataset目录下，检索2013年1月1日至今，人类肾透明细胞癌组织及对照组织表达的数据集，设置检索式为(("kidney"[MeSH Terms]OR Kidney[All Fields]) AND ("carcinoma，renal cell"[MeSH Terms]OR Renal Clear Cell Carcinoma[All Fields])) AND "Homo sapiens"[porgn]AND ("gse"[Filter]AND "Expression profiling by array"[Filter]AND "attribute name tissue"[Filter]AND ("2013/01/01"[PDAT]："2018/09/25"[P-DAT]))，结果再筛选能够获取注释文件及平台信息的数据集，纳入GSE40435、[7]GSE53757、[8]GSE68417[9]三个数据集，使用GEO2R网络在线工具对获取的数据集进行差异基因分析，P＜0.05被认为具有统计学意义，将上调的差异基因用Venny 2.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.e-s/tools/venny/index.html)绘制韦恩图。

1.3 靶基因的预测及实验验证靶基因的查找

miRDIP数据库[10]预测Minimum Score为very high且来源数据库大于15个的靶基因。通过mirtarbase[11](更新于Sept. 15，2017)查找实验验证的靶基因，同时查阅文献寻找2017年9月15日后发表文献中涉及到的miR-506-3p靶基因，以上三者的并集被纳入作为靶基因集合，将差异基因与靶基因集合取交集作为候选靶基因进行下一步分析。

1.4 构建蛋白互作网络

将上述的到的候选靶基因导入networkanalyst[12](http：//www.networkan-alyst.ca/face-s/home.xhtml)构建miR-506-3p靶基因编码蛋白质互作用网络。

2 结果

2.1 miR-506-3p在肾透明细胞癌表达

starbase中的starBase Pan-Cancer Analysis Platform中，来自TCGA的miRNA seq表达数据通过log2(RPM + 0.01)表示并绘得箱型图(图1)，miR-506-3p在正常样本中(71例)的表达高于肾透明细胞癌样本(517例)(P=1.6×10-61)。

图1 miR-506-3p在肾透明细胞癌表达下调

2.2 GEO2R获取上调的透明细胞癌差异基因

经过GEO2R工具，GSE40435筛得17892个差异表达基因，其中上调基因7363个下调基因10529个、GSE53757筛得28021个差异表达基因其中上调基因7855个，下调基因20166个、GSE68417筛得10157个差异基因，其中上调基因4892个，下调基因5265个。三个数据集晒出的上调差异基因取交集共得到2975个在三者均为上调的差异基因。

2.3 靶基因预测结果及实验验证靶基因

miRDIP预测到靶基因共计Minimum Score为very high、来源数据库大于等于15个的靶基因共计 431个，Mirtarbase数据库查找到FXN、SNAI2、CD151、VIM、CDK4、CDK6六个基因为拥有强证据荧光素酶报告实验、westen blot、qPCR)支持的靶基因。经查阅文献，FLOT1、[5]IL8、[13]NEK6、[14]JAG1、[15]RAB3D、[16]STAT3、[17]BECN1、[18]CREB1、[19]KLF4、[20]KLF5[20]亦被纳入作为候选靶基因。以上三者的并集共计442个基因作为靶基因集合(图3.左)，与差异上调基因取交集得到116个候选靶基因(图3.右)。

图2 三个数据集上调差异基因的交集

图3 靶基因交集（左）和候选靶基因（右）

2.4 蛋白互作网络

Networkanalyst绘制的蛋白互作网络，图中显示hasmiR-506-3p的靶基因编码的蛋白间有着复杂的互相作用关系(图4)，互作数量排名前十的基因为：UBC、SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ELAVL1、ETS1、BCL6、IQGAP1、APP。其 中SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1七个基因为前文得到的hsa-miR-506-3p在肾透明细胞癌中作用的候选靶基因。

3 讨论

MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在真核基因转录后表达调控中有着广泛的作用。miRNA参与到了几乎所有生物过程中，异常的miRNA表达通常与癌症有关。自2002年，Calin等发现miR-15 and miR-16在慢性淋巴细胞白血病中频繁缺失和下调以来[21]，越来越多的研究发现miRNA可以发挥癌基因或抑癌基因作用，在肿瘤发生、发展、预后中扮演十分重要的角色。

miR-506-3p在多种肿瘤中下调，作为一种抑癌基因被研究，并通过靶向调控多个基因在肿瘤中发挥作用。目前的研究发现，miR-506-3p。在某些情况下miR-506-3p亦可在肿瘤中发挥不同的作用，如黑色素瘤中其作为癌基因存在[22]，在羟基喜树碱(HCPT)抗性人结肠癌细胞中过表达等[23]。

本文通过生物信息学的手段，对miR-506-3p在肾透明细胞癌中的作用进行了初步的探究，starBase Pan-Cancer Analysis Platform的结果显示，miR-506-3p在肾透明细胞癌中较正常组织低下调，这与现有关于miR-506-3p在肾透明细胞癌中的研究相同，故本文认为其在肾透明细胞癌中下调是可信的。

图4 蛋白互作网络

本文研究得到SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1七个可能的miR-506-3p在肾透明细胞癌的中发挥作用的靶基因。此七个基因在肿瘤中的发生发展均得到了广泛研究，除IQGAP1外，其余基因在肾透明细胞癌中的作用都有报道[19,24-27]。值得一提的是，有文献报道SP1在pVHL抑制转录中起着关键作用[28]。本次研究发现miR-506-3p有可能通过作用于SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1从而参与到肾透明细胞癌的发生发展中。但由于缺乏实验数据支持，本研究的结论仍有待进一步验证以探索其在肾透明细胞癌中的机制，以及其在诊断和分子治疗中的应用。