珍斛颗粒对肝阳上亢型高血压病人血管内皮细胞的影响

杨 丹，叶 攀，蔡三金，刘宏军，敖杰男

高血压具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点，是心脑血管疾病死亡的主要原因之一。高血压是常见的慢性非传染病之一，长期血压升高导致机体心、脑、肾及视网膜等重要靶器官损伤和衰竭。中医学认为高血压属“眩晕病”，主要病机为痰浊内阻、肝阳上亢、瘀血阻络、肾阳不足等。临床研究表明，眩晕病常见的临床病机是肝阳上亢[1]。有研究显示，中医方剂能有效控制病人血压，改善临床症状，并有助于下调内皮素1(ET-1)水平，从而保护内皮细胞，改善血管功能[2]。珍斛颗粒是宜昌市中医医院院内制剂，功效为平肝息风、滋阴潜阳[3]。本研究观察珍斛颗粒对肝阳上亢型高血压病人血管内皮细胞ET-1 mRNA和血栓调节蛋白(TM)mRNA的影响。

1 资料与方法

1.1 病例选择标准

1.1.1 诊断标准 高血压诊断及分级参照《中国高血压防治指南(2019年修订版第三版)》制定；肝阳上亢辨证分型参照《证候类中药新药临床研究技术指导原则》(2018版)中医高血压诊断的分型标准[4]。

1.1.2 病例纳入标准 年龄>40岁，性别不限；确诊为原发性高血压3级；根据《中药新药临床研究指导原则》中医辨证分型为肝阳上亢型[5]，主要症状：头晕目眩、头胀头痛；次要症状：烦躁易怒、口苦咽干、面色潮红、潮热多梦、夜寐不安，舌质红，苔薄黄，脉弦有力；符合主要症状及两项次要症状即可纳入。本研究通过医院伦理委员会批准，且所有病人均签署知情同意书。

1.1.3 病例排除标准 不符合上述纳入标准；高血压靶器官损害，包括心绞痛、心肌梗死、严重心力衰竭、脑卒中、动脉夹层、视网膜出血等；合并严重消化道出血、呼吸系统、造血系统疾病及精神疾病等；肝肾功能异常，血肌酐超过正常上限；妊娠期高血压；对研究药物过敏；3个月内曾参与其他药物研究。

1.2 临床资料 选取三峡大学附属中医医院心血管科收治的病人90例为研究对象，其中男46例，女44例；年龄(57.4±9.5)岁；病程0.3～26.0(15.1±8.9)年；用药前血压(171.2±16.9)/(105.4±15.1)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。采用随机数字表法分为对照组、模型组和药物组，各30例。3组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。同时选取年龄、性别匹配的健康志愿者30名作为正常组。

1.3 治疗方法 对照组给予常规降压治疗，药物组给予珍斛颗粒联合常规降压治疗，珍斛颗粒由宜昌市中医医院药剂科提供，组方：珍珠母30 g，石斛15 g，煅龙牡30 g，石决明20 g，玄参15 g，夏枯草10 g，怀牛膝15 g，野菊花15 g，每日3次口服，饭后服用，每次200 mL，规律服药2个月待血压持续达标后采集受试者血液。各组研究对象治疗期间均按照要求给予低盐、低脂饮食，规律作息，调畅情志，忌烟、酒，忌用抗生素等可能影响试验结果药物。

1.4 实验材料 抽取健康志愿者、模型组病人服药前、药物组病人常规服用常规降压药物达标并连续服用珍斛颗粒2个月后、对照组病人服用常规降压药物达标2个月后血液，均提取血清。

1.4.1 实验细胞 人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)，由暨南大学医学院细胞学实验室提供。

1.4.2 主要试剂 购自杭州四季青公司的胎牛血清、胰蛋白酶、含1%双抗DMEM培养基；购自美国Invitrogen公司的Trizol总RNA提取试剂盒、RT-实时荧光定量(PCR)试剂盒。

1.4.3 实验仪器 美国Thermo Fisher Scientific公司的CO2培养箱、冷冻离心机；苏州博力斯公司的超净工作台；美国Syngene公司的全自动凝胶成像分析仪及分析系统；日本ASTEC公司的梯度基因扩增仪和电泳槽；引物合成试剂盒由上海生工工程技术服务有限公司提供。

1.4.4 实验方法

1.4.4.1 细胞培养及分组 复苏的冻存HUVEC-C细胞株，置于气相：空气95%，CO25%；温度37 ℃，培养箱湿度70%～80%，DMEM培养基含15%胎牛血清及含1%双抗，细胞生长接近指数生长期进行传代，取对数生长期的单层培养细胞接种到96孔培养板，每孔1×105个细胞。实验分组：正常组用含10%健康志愿者血清培养基继续培养24 h；模型组用含10%肝阳上亢型高血压病人服药前血清培养基继续培养24 h；药物组用含10%药物组病人服药后血清培养基继续培养24 h；对照组用含10%对照组研究对象血清培养基培养24 h。每组9个复孔。

1.4.4.2 PCR测定HUVEC-C中ET-1 mRNA和TM mRNA表达 离心各组悬浮细胞备用，参照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。ET-1、TM和内参照β-actin，GAPDH和引物借助primer 6.0软件设计，并经Genebank验证，详见表2。总RNA逆转录成cDNA，PCR反应体系50 μL，存放于-20 ℃。ET-1反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。TM反应条件：94 ℃预变性5 min，1个循环，94 ℃变性40 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。各取PCR产物DNA 5 μL+dd H2O 3 μL+溴酚蓝2 μL共10 μL混合后依次滴入加样孔中，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1 h(电压90 V)，清水漂洗后置于紫外线透射仪上观察结果，并通过凝胶摄像系统照相记录，光密度扫描仪分析各条带光密度，以β-actin、GAPDH表达量为对照计算并比较各组ET-1 mRNA、TM mRNA相对表达量，进行半定量分析[6]。实验重复3次。

表2 RT-PCR引物

2 结 果

2.1 各组PCR电泳图 分析结果表明，与正常组比较，模型组ET-1 mRNA产物条亮度最强，表明表达增多，TM mRNA产物条带亮度最暗，说明表达减少，药物组和对照组ET-1 mRNA、TM mRNA产物条带亮度介于模型组和正常组之间。详见图1、图2。

图1 PCR检测ET-1 mRNA表达

图2 PCR检测TM mRNA表达

2.2 各组ET-1 mRNA和TM mRNA表达比较(见表2)

表2 各组ET-1 mRNA和TM mRNA表达比较(±s)

3 讨 论

高血压患病率高，但知晓率、治疗率及控制率较低，是世界范围内的心血管疾病防治难题。高血压作为一种全身性疾病，长期患病且血压控制不佳对机体多个重要脏器造成不同程度的功能性和器质性损害，特别在高致死率心血管疾病中高血压是首要危险因素。目前，高血压主要采用西药治疗，但由于西药种类较多，受服药禁忌证、不良作用及服药依从性等影响，我国中医学的整体观及辨证论治观点在高血压的治疗上具有较大优势。本研究在高血压基础上将中医辨证施治应用于高血压的防治中，总结归纳多年医疗实践经验，创制了具有平肝息风、滋阴潜阳的珍斛颗粒。

心血管性疾病的病理基础是内皮细胞损伤，高血压病人血压升高导致血管因长期压力负荷过重，出现持续性血管痉挛及血管内膜损伤，从而诱发炎症反应和纤溶系统失衡，脂质沉积，进而导致血流动力学改变[7]。有研究证实，血管压力持续升高造成血管内皮出现病理性损伤，引起一系列炎症反应，从而导致纤溶系统失衡[8]。正常的血管内皮细胞通过合成和分泌生物活性因子调节血管收缩和舒张，控制血压水平，并且具有维持抗凝和纤溶平衡功能。

ET-1是由内皮细胞合成和释放的，具有强烈而持久的缩血管作用，还可促进细胞增殖和肥大，最终引起细胞凋亡和血管粥样硬化[9]。高血压引起动脉粥样硬化性疾病，与ET-1过度表达有关，有效控制血压和降低ET-1可预防动脉粥样硬化性疾病发生。如何调节ET和一氧化氮合酶系统平衡已成为预防和阻止动脉粥样硬化导致的心脑血管疾病的研究热点。

TM是存在于内皮细胞表面的单链抗凝糖蛋白和细胞膜的凝血酶调节蛋白，即凝血酶受体。TM是反映内皮细胞受损的敏感特异标志物之一，可调节机体凝血功能，内皮细胞损伤，凝血酶释放到血液中，从而启动体内凝血系统，导致血液处于高凝状态，引起血栓性疾病[10]。TM能有效降低凝血酶活性，防止凝血系统过度激活，保护血管内皮细胞，延缓动脉粥样硬化的进程。相关研究表明，TM与动脉粥样硬化、血栓形成等凝血功能病理变化密切相关[11]。

珍斛颗粒是宜昌市中医医院院内制剂，主要组分珍珠母能平肝潜阳、清肝泻火；石斛具有滋阴清热的功效。该方能有效控制病人血压并改善症状。本研究采用病证结合型，将高血压肝阳上亢型病人血清作为模型，避免动物造模辨证困难等相关问题。

现有研究结果表明，肝阳上亢型高血压病人可能通过ET-1 mRNA和TM mRNA表达导致血管内皮细胞损伤，珍斛颗粒可降低肝阳上亢型高血压病人血清ET-1 mRNA表达，上调TM mRNA表达，从而有效保护血管内皮细胞。