CYP3A5基因多态性对肾移植受者他克莫司代谢的影响

张异蕊 郭予和 陈 正

1 引言

目前，他克莫司（Tacrolimus，FK506）是肾移植术后应用最广泛的免疫抑制剂，有效降低了术后排斥发生率［1-2］。然而，他克莫司治疗窗窄、个体间药物代谢动力学差异大，按照“标准剂量”给药，个体间药物浓度明显不同，临床上经常出现偏离目标浓度的现象。因此，他克莫司用药剂量必须根据治疗药物监测（Therapeutic drug monitoring，TDM）结果不断进行调整。

细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是一种人体内重要的药物代谢酶［3-5］，其亚家族CYP3A5主要在肠道和肝表达，是他克莫司在人体内的主要代谢酶。CYP3A5的活性很大程度上取决于CYP3A5×3单核苷酸多态性，该基因6989（A/G）位点的突变可导致其翻译出无功能的蛋白质，使得CYP3A5 GG基因型携带者不能表达有酶活性的CYP3A5蛋白质，影响他克莫司在体内代谢。本研究以我院肾移植受者为对象，探讨CYP3A5基因多态性对他克莫司标准化血药浓度（Dose adjusted blood concentration，C0/D）的影响，分析 CYP3A5×3基因多态性与肾移植受者术后急性排斥反应和感染的相关性，为肾移植受者术后个体化用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年1月—2017年12月在广州医科大学附属第二医院接受初次肾移植的受者为研究对象。

纳入标准：①18周岁以上；②术后免疫抑制剂方案采用他克莫司+霉酚酸酯+激素，且维持该方案至少2年。

排除标准：①术后1个月内肾功能不全；②因手术原因移植物失功；③服用利福平、红霉素等影响CYP酶活性药物；④术后发生移植肾功能延迟恢复（DGF）和失访的受者；⑤术后肝功能异常的受者；⑥患有贫血、低蛋白血症和精神性厌食症或胃肠切除术后等影响药物吸收的受者；⑦多器官联合移植受者。本研究共纳入受者190例，随访期为2年。

1.2 CYP3A5基因型分析

采用天根基因组提取试剂盒（DP318-02）提取全血的基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。采用紫外分光光度计检测DNA的纯度及浓度，确保DNA浓度在30 ng/μl左右。采用聚合酶链反应-限制性片段长度（Poly merase chain reaction-restriction fragement length polymorphism，PCR-RFLP）方 法 检 测CYP3A5×3基因多态性（试剂盒来自于天津市秀鹏生物技术开发有限公司）。PCR反应程序如表1所示，PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，于紫外凝胶成像系统下观察并判读结果。

表1 PCR循环参数

1.3 C0的测定

采集受者术后不同时间点（7天、1个月、3个月、6个月、1年和2年）清晨空腹静脉血2～4 mL，采用酶联免疫放大法（Enzyme linked immunoamplification，试剂盒来自珠海丽珠试剂有限公司）检测C0，并进行校正。以竞争药物（他克莫司代谢物）抗体结合位点为基础，样品中的他克莫司代谢物与用葡萄糖6磷酸脱氢酶标记的药物竞争抗体结合位点，未结合的酶可将辅助因子NAD转化为还原性的NADH，从而造成吸光度改变。通过分光光度计340 nm进行测量。计算3组受者术后不同时间点有效的血他克莫司浓度/剂量（C0/D）值。C0为他克莫司谷浓度（ng·ml-1），D为受者每日每公斤体质量所服用他克莫司毫克数（mg·kg-1·d-1），C0/D值单位为 ng·mL-1·d·kg。

1.4 急性排斥反应（AR）诊断

依据以下临床症状诊断排斥反应：①尿量减少、血压升高、发热、体重增加；②移植肾区变硬、胀痛、肿大；③伴有乏力、肌肉关节酸痛、纳差、腹胀、心动过速甚至精神异常等全身症状；④检查指标血清肌酐（SCr）或内生肌酐清除率（Ccr）升高；⑤移植肾多普勒彩超检查符合急性排斥反应影像学特征；⑥必要时行移植肾穿刺活检。

1.5 感染

为减少不同类型感染的影响，本研究仅纳入有明显影像学依据的肺部感染作为统计的唯一指标。包括：细菌性肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、结核感染、混合性感染、不明病原菌肺部感染（具备明确临床症状及影像学特征，但未检出任何病原菌者）。当患者出现发热及咳嗽等症状时，进行肺部CT检测、病原学检查诊断肺部感染。

1.6 统计分析

采用SPSS（19.0版）统计软件处理。各组患者年龄、BMI、HLA错配、术后不同时间点受者的他克莫司C0/D值均以均数±标准差表示，不同基因型患者性别构成比比较采用χ2检验，不同基因型受者年龄、BMI、HLA错配及术后不同时间点受者的他克莫司C0/D值比较采用单因素方差分析（不满足方差分析则用Kruskal-Wallis秩和检验）。三组间排斥反应发生率和感染发生率的比较采用行×列表的卡方检验，对于理论频数＜1的采用fisher’s确切概率法，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受者一般资料及CYP3A5基因多态性检测结果

190例受者中，男117例，女73例，年龄为43.25±13.81岁，BMI为22.14±3.31 kg/m2、HLA错配为3.55±1.21个。其中，CYP3A5×1/×1型24例（12.7%），CYP3A5×1/×3型66例（34.7%），CYP3A5×3/×3型100例（52.6%）。3组受者年龄、性别构成比、BMI和HLA错配数比较差异均无统计学意义（P＞0.05），3组受者一般资料具有可比性，见表2。

表2 CYP3A5不同基因组受者一般资料

2.2 各组受者不同时间点他克莫司C0/D值

术后7天、1个月、3个月、6个月、1年和2年时，CYP3A5×3/×3组受者的 C0/D值分别为123.21±23.84 ng·mL-1·d.kg、139.41±19.77 ng·mL-1·d·kg、131.54±21.35 ng·mL-1·d·kg、134.21±20.18 ng·mL-1·d·kg、125.36±17.70 ng·mL-1·d.kg、134.24±26.17 ng·mL-1·d·kg；CYP3A5×1/×1组受者各时间点为：46.71±17.99 ng.mL-1·d·kg、56.67±18.71 ng·mL-1·d·kg、55.33±17.72 ng·mL-1·d·kg、54.21±18.21 ng·mL-1·d·kg、48.13±15.25 ng·mL-1·d·kg、54.14±19.13 ng·mL-1·d·kg；CYP3A5×1/×3组受者各时间点为：54.25±17.82 ng·mL-1·d.kg、59.41±15.96 ng·mL-1·d·kg、61.22±16.93 ng·mL-1·d·kg、64.13±16.85 ng·mL-1·d·kg、61.32±14.75 ng·mL-1·d.kg、59.11±17.27 ng·mL-1·d·kg。CYP3A5×3/×3组受者的C0/D值各时间点均高于明显高于CYP3A5×1/×1组受者和CYP3A5×1/×3组受者，差异均具有统计学意义（P＜0.05），CYP3A5×1/×1组和CYP3A5×1/×3组患者各时间点C0/D值无统计学差异（表3和图1）。

表3 CYP3A5基因多态性与剂量和浓度剂量比的关系

图1 CYP3A5不同基因型组C0/D比较

2.3 CYP3A5基因多态性与急性排斥反应的关系

3组术后2年内发生急性排斥反应共有20例，其中，CYP3A5×1/×1组7例，CYP3A5×1/×3组7例，CYP3A5×3/×3组6例。如表3显示，CYP3A5×1/×1组6例急性排斥反应发生时间为：术后7天至术后1月间1例，术后1月至术后3个月间3例，术后6月至1年间1例，术后1年至2年间2例。CYP3A5×1/×3组14例急性排斥反应发生时间为：术后1月至术后3个月间3例，术后6月至1年间2例，术后1年至2年间2例。CYP3A5×3/×3组6例急性排斥反应发生时间为：术后7天至术后1月间1例，术后1月至术后3个月间2例，术后半年至1年间1例，术后1年至2年间2例，见表4。3组急性排斥反应通过甲基等药物冲击治疗后均得到逆转，移植肾功能得到恢复。术后2年内CYP3A5×1/×1组急性排斥反应发生率高于 CYP3A5×1/×3组和CYP3A5×3/×3组（P=0.032，P＜0.001），而术后2年内CYP3A5×1/×3组和CYP3A5×1/×3组急性排斥反应发生率无统计学差异（P=0.28）。

2.4 CYP3A5基因多态性与感染的关系

术后2年内发生感染共有47例，其中，CYP3A5×1/×1组6例，CYP3A5×1/×3组14例，CYP3A5×3/×3组27例。CYP3A5×1/×1组6例感染发生时间为：术后1月内1例，术后1月至术后3个月间3例，术后半年至1年间1例，术后1年至2年间1例。CYP3A5×1/×3组14例感染发生时间为：术后1月至术后3个月间9例，术后半年至1年间3例，术后1年至2年间2例。CYP3A5×3/×3组27例感染发生时间为：术后1月内3例，术后1月至术后3个月间12例，术后半年至1年间8例，术后1年至2年间4例。术后2年内各组感染总发生率无统计学差异（P＞0.05）。

表4 不同CYP3A5基因组急性排斥反应发生时间

3 讨论

他克莫司（Tacrolimus，FK506）是钙调磷酸酶抑制剂，作为一种有效的免疫抑制药物，是肾移植术后免疫维持方案的基础用药之一。目前，临床上常规给予相同体重剂量的药物，并根据TDM结果对初始剂量进行调整［6］。但由于他克莫司治疗窗窄、药动学差异大，使得移植术后的受者需要较大剂量范围和较长时间的调整，部分受者由于给药剂量过低造成移植物的急性排斥导致移植失败，或者给药剂量过高导致感染及肝、肾毒性等不良反应发生急性排斥反应［7］，严重影响移植手术治疗效果及受者的生存质量。因此，如何针对肾移植受者制定个体化的免疫抑制方案是目前研究的热点。

学者们通过药物基因组学研究遗传因素对药物反应的影响，发现CYP3A5蛋白是影响他克莫司代谢的关键酶，该酶活性主要受CYP3A5×3基因多态性影响［8］。CYP3A5×3（6986A＞G）碱基突变可导致翻译出无功能的CYP3A5蛋白［9］。CYP3A5的表达与活性呈高度多态性，个体及种族间差异性较大。有研究［9-10］报道指出：CYP3A5×3等位基因突变频率在中国汉族、维吾尔族、哈萨克族和高加索人群中分别为72.17%、84.18%、86.16% 和91.17%。柳东夫［11］等在65例肾移植受者中发现，CYP3A5×1/×3型29例（44.62%），CYP3A5×3/×3型26例（40.0%），突变率为84.62%。本研究纳入190例受者均为汉族人群，结果显示：CYP3A5×1/×3型66例（34.7%），CYP3A5×3/×3型100例（52.6%），CYP3A5×3的突变率为87.3%，与上述报道基本一致，较高的CYP3A5×3突变率提示了CYP3A5×3基因检测的重要性。

无功能的 CYP3A5蛋白将影响药物代谢［8］，携带CYP3A5×3等位基因的肾移植受者CYP3A5酶的活性低于携带CYP3A5×1等位基因的受者。研究［12］指出：携带CYP3A5×3/×3组基因的受者较携带CYP3A5×1/×1组和CYP3A5×1/×3组受者易于达到目标浓度。本研究结果显示：术后7天、1个月、3个月、6个月、1年和2年时，CYP3A5×3/×3组患者的C0/D值均明显高于CYP3A5×1/×1组和 CYP3A5×1/×3组，而 CYP3A5×1/×1组和CYP3A5×1/×3组患者各时间点C0/D值无统计学差异。上述结果提示携带CYP3A5×1等位基因者需要更高剂量的他克莫司才能达到目标浓度，特别在肾移植早期，浓度尚未稳定时，更需要根据CYP3A5基因分型选择不同的初始剂量。

由于CYP3A5×1等位基因携带者CYP3A5表达水平较高，该酶的活性较强，导致他克莫司体内代谢速度较快，生物利用度较低［13］。因此，CYP3A5×1等位基因携带者他克莫司血药浓度常常较低，容易引起免疫抑制不足，发生急性排斥反应［14］。然而，关于CYP3A5基因多态性与急性排斥反应的相关性，国内不同报道结果并不一致：有研究［15］指出：CYP3A5×1/×1组、CYP3A5×1/×3组和CYP3A5×3/×3组各组间术后2年内急性排斥反应发生率无统计学差异。另有报道［16］指出3个月内CYP3A5×1/×1组急性排斥反应的比例显著高于CYP3A5×1/×3组和 CYP3A5×3/×3组（P＜0.05）。本研究结果显示：术后2年内CYP3A5×1/×1组急性排斥反应发生率高于CYP3A5×1/×3组和CYP3A5×3/×3组（P=0.032，P＜0.001），CYP3A5×1/×3组和CYP3A5×1/×3组急性排斥反应发生率无统计学差异（P=0.28），提示CYP3A5×1/×1组受者容易因为免疫抑制不足而发生急性排斥反应。由于CYP3A5×1/×1组受者需要更大的剂量才能达到目标浓度，增加了发生急性排斥反应的风险［13］，故 CYP3A5×1/×1受者在肾移植术后要加强急性排斥反应的监测。

感染是肾移植术后常见的并发症［17］，肾移植术后预防感染与急性排斥反应影响移植受者/器官长期存活的重要因素。国外研究显示［18-19］：携带不同CYP3A5基因肾移植受者感染发生率无统计学差异。国内庞路新等［20］也有相似的研究结果。为减少不同类型感染的影响，本研究纳入有明显影像学依据的肺部感染作为统计的唯一指标。本研究结果显示：术后2年内发生感染共有47例，其中，CYP3A5×1/×1组6例，CYP3A5×1/×3组14例，CYP3A5×3/×3组27例。术后2年内各组间感染发生率无统计学差异（P＞0.05），与文献报道一致。从结果可以看出，肾移植受者感染在3个月内居多，CYP3A5×1/×1组术后3个月内发生4例，CYP3A5×1/×3组术后3个月内发生9例，CYP3A5×3/×3组术后3个月内15例，这与前期免疫抑制剂药物浓度调整有关。

综上所述，本研究结果提示：CYP3A5基因多态性对肾移植术后受者他克莫司药物代谢有显著影响，可作为肾移植受者他克莫司个体化用药的指导依据。