ANRIL表达水平与妊娠期糖尿病的相关性分析

洪琳凤 李桦 郭晴虹 肖鸽飞 金丰梅 尹保民 张超敏 严津晶 蔡鹏飞 李兆生

【摘要】 目的：分析細胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA（ANRIL）表达水平与妊娠期糖尿病（GDM）的相关性。方法：选择2019年7月-2020年6月于本院产科进行产检并分娩的妊娠期妇女122例，根据孕24～28周口服葡萄糖耐量试验（OGTT）结果是否异常将其分为OGTT异常组（n=61）和OGTT正常组（n=61）。比较两组血清激素[雌二醇（E2）、孕酮（P）]水平以及lncRNA ANRIL表达水平，分析lncRNA ANRIL表达水平与GDM患者激素水平的相关性。结果：两组孕期体重增加、FPG、餐后1 h血糖、餐后2 h血糖比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。OGTT异常组血清E2、P水平均显著高于OGTT正常组，差异均有统计学意义（P<0.05）。OGTT异常组血清lncRNA ANRIL mRNA表达水平显著高于OGTT正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关分析显示，血清lncRNA ANRIL mRNA表达与GDM患者E2、P水平均呈明显正相关（P<0.05）。logistic回归模型分析结果显示，lncRNA ANRIL是影响GDM发生的危险因素（P<0.001）。结论：GDM患者lncRNA ANRIL表达水平显著升高，并与激素水平呈显著正相关，lncRNA ANRIL表达升高可能是机体抵抗胰岛功能的影响因素。

【关键词】 妊娠期糖尿病 细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA 雌二醇 孕酮 相关性

Correlation between ANRIL expression level and gestational diabetes mellitus/HONG Linfeng， LI Hua， GUO Qinghong， XIAO Gefei， JIN Fengmei， YIN Baomin， ZHANG Chaomin， YAN Jinjing， CAI Pengfei， LI Zhaosheng. //Medical Innovation of China， 2021， 18（05）： -146

[Abstract] Objective： To analyze the correlation between expression level of antisense non-coding RNA in the INK4 locus （ANRIL） and gestational diabetes mellitus （GDM）. Method： A total of 122 pregnant women who underwent obstetric examination and delivery in our hospital from July 2019 to June 2020 were selected. According to the abnormal results of oral glucose tolerance test （OGTT） at 24 to 28 weeks of pregnancy， they were divided into abnormal OGTT group （n=61） and normal OGTT group （n=61）. The levels of serum hormones [estradiol （E2）， progesterone （P）]and expression level of lncRNA ANRIL were compared between the two groups. The correlation between expression level of lncRNA-ANRIL and hormones levels were analyzed among GDM patients. Result： There were statistically significant differences in weight gain， FPG， 1 h postprandial blood glucose and 2 h postprandial blood glucose during pregnancy （P<0.05）. Serum E2 and P levels in the abnormal OGTT group were significantly higher than those in the normal OGTT group， with statistical significance （P<0.05）. The expression level of lncRNA ANRIL mRNA in serum of OGTT abnormal group was significantly higher than that of OGTT normal group， with statistical significance （P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that serum lncRNA ANRIL mRNA expression was significantly positively correlated with E2 and P levels in GDM patients （P<0.05）. Logistic regression model showed that lncRNA ANRIL was a risk factor for the occurrence of GDM （P<0.001）. Conclusion： The expression level of lncRNA ANRIL in patients with GDM is significantly increased， and is significantly positively correlated with the levels of hormones. The increase of lncRNA ANRIL expression may be an influencing factor for the bodys islet resistance function.

[Key words] Gestational diabetes mellitus Antisense non-coding RNA in the INK4 locus Estradiol Progesterone Correlation

First-authors address： Zhuhai Maternal and Child Health Care Hospital， Zhuhai 519000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.05.036

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus， GDM）是高危妊娠的重要原因之一[1]。早診断、早治疗对改善妊娠期糖尿病患者临床结局有着极其重要的意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA， lncRNA）是指一类无开放阅读框的含有200个核苷酸的RNA，lncRNA参与了包括糖尿病在内的各种疾病的病理过程[2]。细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 locus， ANRIL）又被称为lncRNA ANRIL，是最早发现的lncRNA之一[3]。全基因组关联研究表明，lncRNA ANRIL是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）的遗传易感位点[4]，染色体9p21区域糖尿病相关危险变异子与ANRIL表达的下调相关。目前研究认为，lncRNA ANRIL可能是通过调节INK4b-ARF-INK4a基因[5-6]，并通过多种机制参与2型糖尿病的发病过程。但其是否与GDM发病有关，目前未见相关报道。据此，本文通过研究ANRIL表达水平与妊娠期糖尿病的相关性，旨在为妊娠期糖尿病的早诊断、早治疗提供新的参考根据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年7月-2020年6月于本院产科进行产检并分娩的妊娠期妇女122例，年龄22～42岁，年龄（31.35±4.32）岁。根据孕24～28周口服葡萄糖耐量试验（OGTT）结果是否异常将其分为OGTT异常组（n=61）和OGTT正常组（n=61）。（1）纳入标准：①OGTT异常组符合妊娠期糖尿病诊断标准[7];②均为单胎妊娠;③孕前均无糖尿病史。（2）排除标准：①合并妊娠期高血压;②其他内分泌疾病或激素相关疾病;③存在其他可能影响血糖水平的基础疾病;④唐氏筛查及三维超声提示胎儿异常;⑤近期服用对血糖水平造成影响的药物。患者及其家属知情同意，并签署知情同意书。本次研究得到珠海市妇幼保健院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 入选对象在第1次产前检查时（孕11～13+6周），于空腹状态下测量血压、身高、体重、孕次、产次，同时检测其糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c， HbA1c）、空腹血糖（fasting plasma glucose， FPG），结果均正常，排除糖尿病合并妊娠。至孕24～28周进行OGTT及血清激素[雌二醇（estradiol， E2）、孕酮（progesterone， P）]检测，并检测外周血lncRNA ANRIL基因表达。

1.2.2 血清生化指标检测 孕24～28周，入选对象均于禁食12 h后，募集晨起空腹静脉血4 mL，4 ℃静置30 min，3 000 r/min离心15 min，留上清，采用化学发光法检测两组E2、P水平。

1.2.3 血清lncRNA ANRIL表达检测 采用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction， qRT-PCR）检测孕妇血清lncRNA ANRIL相对表达量，具体步骤如下，（1）血清样本收集：收集两组孕妇空腹静脉血4 mL，方法同上，-80 ℃超低温冻存;（2）血清总RNA提取：采用过滤柱层析法RNA提取试剂（聚合美，北京）抽提淋巴细胞的总RNA，用First strand cDNA synthesis试剂盒（艾基生物，广州）将总RNA反转录生成互补脱氧核糖核酸（cDNA），使用Ipure SYBR Green qPCR Master Mix universal试剂盒（艾基生物，广州）对cDNA进行相对定量检测;（3）qRT-PCR分析：实时荧光定量PCR扩增仪为ABI-7500 RT-PCR系统（Applied Biosystems，美国），选择的程序为“Relative Quantification （ddCt） Plate”[相对定量（ddCt）反应板]，上机前的实验操作均在冰板上进行，所有实验耗材均已去RNA酶处理，PCR参数为：95 ℃15 min→95 ℃15 s、56 ℃30 s、72 ℃40 s，45个循环→95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s，60 ℃15 s，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）作为内参，所有qRT-PCR均做3复孔检测，采用2-△△Ct进行基因相对定量水平的计算。见表1。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。血清lncRNA ANRIL表达与GDM患者激素水平的相关性用Pearson相关检验分析，GDM发生的影响因素采用二元logistic回归模型分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较 两组孕妇年龄、体质指数、身高、孕前体重、分娩时体重、孕次、产次、HbA1c比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。两组孕期体重增加、FPG、餐后1 h血糖、餐后2 h血糖比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.2 两组血清激素水平比较 OGTT异常组血清E2、P水平均显著高于OGTT正常组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.3 两组血清lncRNA ANRIL表达水平比较 OGTT异常组血清lncRNA ANRIL mRNA表达水平为（1.21±0.31），显著高于OGTT正常组的（0.73±0.19），差异有统计学意义（t=9.845，P<0.05）。

2.4 血清lncRNA ANRIL表达与GDM患者激素水平的相关性分析 Pearson相关分析显示，血清lncRNA ANRIL mRNA表达与GDM患者E2、P水平均呈明显正相关（r=0.379，P=0.003;r=0.507，P<0.001），见图1。logistic回歸模型分析结果显示，剔除血糖、激素水平等因素影响，lncRNA ANRIL是影响GDM发生的危险因素[OR=5 055.075，95%CI（268.506，95 170.299），P<0.001]。

3 讨论

GDM是指妊娠期出现或首次发现的葡萄糖不耐受，是妊娠期最常见的并发症之一[8]。GDM患者可发生代谢和免疫变化，临床上表现为胰岛素抵抗和对胎儿及胎盘免疫耐受增加[9]。此外，GDM患者不良妊娠结局风险明显增加，进而对母体和胎儿造成威胁[10]。GDM危险因素包括孕前体重增加、肥胖、糖尿病家族史、高龄及饮食不良等，亦有研究指出，孕早期低甲状腺激素水平与GDM风险增加有关，并可能影响妊娠结局和婴儿智力水平[11]。然而GDM病因和发病机制并不完全明确。目前临床诊断GDM的方法仍依赖于OGTT，血糖一项及以上达到或超过异常标准可诊断。但随着孕周增加，孕妇体内拮抗胰岛素样物质增加，如雌激素、孕激素、HPL等使孕妇对胰岛素的敏感性随孕周增加而下降，故部分孕妇孕中期OGTT正常，但随着孕周的增加，孕晚期可能出现OGTT，而该部分患者容易漏诊或确诊延迟，进而引起严重后果。因此寻找新的生物标志物，对于GDM的发现和治疗具有重要意义。

lncRNA不编码蛋白质，广泛存在于基因组中，lncRNA表达异常与多种疾病有关。lncRNA ANRIL主要定位于细胞核，又被称为CDKN2B-AS，是人Chr9p21.3上INK4b（CDKN2B）-ARF-INK4a（CDKN2A）基因簇转录的长链非编码RNA[12]。证据表明，lncRNA ANRIL异常表达以及单核苷酸多态性与包括糖尿病在内的疾病有关[13]。Guo等[14]报道指出，lncRNA ANRIL通过介导NF-κB信号通路促进人冠状动脉内皮细胞炎性细胞因子释放，其表达与冠心病患者累积存活时间呈显著负相关。亦有研究指出，CDKN2A/B基因异常甲基化可能与胰岛β细胞功能障碍和糖尿病有关[15]。进一步研究发现，CDKN2A/B位点单核苷酸多态性rs564398等位基因携带者降低了T2DM患者胰岛β细胞增殖指数，其可能通过调节胰岛基因表达和胰岛β细胞增殖而影响T2DM发病[16]。故认为lncRNA ANRIL可能是预测GDM的新型生物标志物。本文研究结果显示，OGTT异常组血清E2、P水平均显著高于OGTT正常组（P<0.05），表明GDM患者激素水平显著升高。具体而言，胰岛素抵抗是糖尿病的主要生理特征，妊娠期间由于雌激素、P的合成以及胎盘的生成，E2、P水平逐渐升高，进而影响胰岛素功能，导致胰岛功能降低，故激素水平可在一定程度上指示GDM患者病情严重程度。本文研究结果还显示，OGTT异常组血清lncRNA ANRIL mRNA表达水平显著高于OGTT正常组（P<0.05），表明GDM患者lncRNA ANRIL mRNA表达明显上调，并可能参与了GDM发病过程。分析原因，CDKN2A/B能够调节胰岛β细胞分泌胰岛素，其单核苷酸多态性可能影响胰岛β细胞增殖能力以及限制胰岛β细胞数量代偿性增加，来增加胰岛β细胞敏感性，进而参与GDM发病过程，此外，CDKN2A/B还具有调节淋巴细胞增殖以及分化的效应，而lncRNA ANRIL又具有调节CDKN2A/B基因座表达的作用，因此lncRNA ANRIL可能在GDM发病过程中发挥作用。进一步相关检验分析结果显示，GDM患者E2、P水平升高时其血清lncRNA ANRIL表达也升高，血清lncRNA ANRIL表达与E2、P水平均呈明显正相关，且lncRNA ANRIL是影响GDM发生的危险因素，表明lncRNA ANRIL对GDM发生可能起促进作用，其高表达可能促进GDM发生。

综上所述，GDM患者lncRNA ANRIL表达水平显著升高，并与激素水平呈显著正相关，lncRNA ANRIL表达升高可能是机体抵抗胰岛功能的影响因素，从分子水平研究与GDM发病相关基因，为GDM早期诊断及未来基因治疗预防有着重要的临床意义。然而GDM发病机制相当复杂，lncRNA ANRIL在GDM中发挥的具体作用机制仍然有待进行更多体内外研究。

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（收稿日期：2020-11-18） （本文編辑：姬思雨）