响应面法优化蟹味菇酶解工艺

江苏食品药品职业技术学院食品学院（淮安 223003）

蟹味菇（Hypsizygus marmoreusBigelow），又名真姬菇，属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶菌族、玉蕈属，是北温带一种优良的食用菌[1]。蟹味菇含有丰富维生素和17种氨基酸，其中赖氨酸、精氨酸的含量高于一般菇类，有助于青少年益智增高，还可抗癌、降低胆固醇[2-3]。蟹味菇子实体的提取物具有真菌多糖、嘌呤、腺苷等多种生理活性成分，能增强免疫力、延缓衰老、促进抗体形成等[4-5]。影响蟹味菇酶解的主要因素有酶用量、pH、温度和时间[6]。通过单因素试验和响应面试验设计，研究确定蟹味菇酶解工艺条件，为蟹味菇的后期加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蟹味菇（产地淮安）；风味蛋白酶（郑州百思特食品添加剂有限公司）；纤维素酶（宁夏和氏璧生物工程有限公司）；氢氧化钠（安徽芜湖化学试剂厂）。

800Y粉碎机（武义海纳电器有限公司）；MS304电子天平（梅特勒-托利多集团）；PHS-3E精密酸度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；TD5G离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 蟹味菇预处理蟹味菇经清洗、沥干后，置于60 ℃条件真空干燥至恒重，然后粉碎成粒径约0.17 mm粉状，待用。

1.2.2 蟹味菇酶解液反应

称取一定量的蟹味菇粉，按照固液比1∶8（g/mL）制成待测液，加入一定量的风味蛋白酶（以底物百分比），调节pH，在设定温度下进行水解处理[7]。水解结束后迅速加热至90 ℃维持10 min灭酶活，冷却后再经4 000 r/min离心15 min，取上清液即得酶解液。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 酶用量对酶解反应的影响

准确量取5份一定量的蟹味菇粉待测液，分别添加相对于底物的0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%的风味蛋白酶，调节pH至7.0，在40 ℃下反应5 h，水解结束后于90 ℃加热10 min灭酶活，以4 000 r/min离心15 min，取上清液，测定氨基酸态氮含量。

1.2.3.2 pH对酶解反应的影响

准确量取5份一定量的蟹味菇粉待测液，加入相对于底物的2.0%风味蛋白酶，分别调节pH至5，6，7，8和9，在40 ℃下反应5 h，水解结束后于90 ℃加热10 min灭酶，以4 000 r/min离心15 min，取上清液，测定氨基酸态氮含量。

1.2.3.3 反应温度对酶解反应的影响

准确量取5份一定量的蟹味菇粉待测液，加入相对于底物的2.0%风味蛋白酶，调节pH至6.0，分别在30，40，50，60和70 ℃下反应5 h，水解结束后于90 ℃加热10 min灭酶，以4 000 r/min离心15 min，取上清液，测定氨基酸态氮含量。

1.2.3.4 反应时间对酶解反应的影响

准确量取5份一定量的蟹味菇粉待测液，加入相对于底物的2.0%风味蛋白酶，调节pH至6.0，在60 ℃下反应，反应时间分别设定为3，4，5，6和7 h，水解结束后于90 ℃加热10 min灭酶，以4 000 r/min离心15 min，取上清液作为酶解液，测定氨基酸态氮含量。

1.2.4 响应面优化酶解反应

比较4个单因素试验结果，确定酶解温度、pH和酶解时间3个因素作为酶解反应主要影响因素，以单因素试验中对酶解反应各因素条件的最优点设置基准点，以Design-Expert 8.0软件Box-Behnken方法进行试验设计[8-10]，以氨基酸态氮含量为评价指标，确定最优的酶解条件，响应面试验设计见表1。

1.2.5 酶解效果评价

此次试验酶解效果评价以酶解液中氨基酸态氮含量表示，酶解液中氨基酸态氮含量越高，则说明酶解效果越好。氨基酸态氮含量的测定方用选用甲醛滴定[11-12]。

称取5.0 g样品，用50 mL 80 ℃左右的蒸馏水分几次洗入100 mL烧杯中，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀后过滤。吸取10.0 mL滤液，置于200 mL烧杯中，加60 mL水，开动磁力搅拌器，用0.050 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH 8.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，计算总酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH 9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时做试剂空白试验，氨基酸态氮含量按式（1）计算。

式中：X为试样中氨基酸态氮的含量，g/100 g；V1为测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V2为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；c为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；0.014为与1.00 mL NaOH标准滴定溶液（c=1.000 mol/L）相当的氮的质量，g；m为称取试样的质量，g；V3为试样稀释液的取用量，mL；V4为试样稀释液的定容体积，mL；100为单位换算系数。

表1 中心组合设计的因素与水平表

2 结果与分析

2.1 酶用量对酶解反应的影响结果

由图1可知，随风味蛋白酶用量的增加，蟹味菇酶解产生的氨基酸态氮含量也相应增加，当酶用量为2.0%时，酶解产物中氨基酸态氮含量达到最大，即酶解程度达到最大，若再继续增加风味蛋白酶用量，酶解产物中氨基酸态氮含量则基本维持恒定，变化不大。综合考虑蛋白酶解条件，选择2%的风味蛋白酶用量为最佳条件。

2.2 pH对酶解反应的影响结果

由图2可知，pH对蟹味菇酶解有较大影响。当pH由5.0至9.0分别进行试验时，随着pH增大，蟹味菇酶解产生的氨基酸态氮含量呈现先增后降趋势，其中pH为6.0时，氨基酸态氮含量达到最大。当pH为5.0到6.0即弱酸性条件时，酶解程度较大，产生的氨基酸态氮含量较高；当pH在7.0到9.0即弱碱性条件时，酶解程度较小，产生的氨基酸态氮含量较低。所以，试验选择pH 6.0时作为最佳酶解pH。

图1 风味蛋白酶用量对蟹味菇酶解结果的影响

图2 酶解pH对蟹味菇酶解结果的影响

2.3 酶解温度对酶解反应的影响结果

由图3可知，随着酶解温度由20 ℃升高至70 ℃，蟹味菇酶解液中氨基酸态氮含量也相应增加，当酶解温度为60 ℃时，氨基酸态氮含量基本达到最大，随后温度继续升高，氨基酸态氮含量逐渐减小，可能是温度过高对酶促化活性产生一定的抑制作用。所以，选择60 ℃作为酶解温度最佳条件。

图3 酶解温度对蟹味菇酶解结果的影响

2.4 反应时间对酶解反应的影响结果

由图4可知，随着酶解时间的不断延长，蟹味菇酶解液中氨基酸态氮含量也相应增加，酶解3～5 h，氨基酸态氮含量不断增加；酶解5 h以后，随时间的继续延长，氨基酸态氮含量基本维持较小波动范围。从酶解彻底性分析，选择6 h作为最佳酶解处理时间。

2.5 响应面法优化酶解反应条件

试验以蟹味菇酶解液中氨基酸态氮含量为响应值（Y），根据Box-Behnken设计原理，安排了17个处理组合，每个处理组合设3个平行样，取平均值，分别确定酶解液中氨基酸态氮含量（Y），试验结果及预测见表2。

图4 酶解时间对蟹味菇酶解结果的影响

表2 响应面分析方案及试验结果

将表2结果代入Design-Expert 8.0进行方差分析，得多元回归方程：Y=5.79-0.15A-0.19B-7.50×10-3C+0.087AB+0.023AC+0.10BC-0.36A2-0.63B2-0.20C2。其中，Y为氨基酸态氮含量，A为酶解温度，B为酶解pH，C为酶解时间。对回归方程进行方差析，结果见表3。

由表3可知，回归模型的p＜0.000 1，检验结果极显著，回归模型失拟项p=0.181 8＞0.05，检验结果不显著，复相关系数R2=0.996 8，说明回归方程拟合程度很好。校正系数R2=0.932 7，说明该模型能解释99.27%响应值变化，说明试验值与预测值非常接近。对回归方程进行分析，得到最佳酶解条件。

由图5～图7可知，当一个因素固定不变时，试验初期随另一因素增大，氨基酸态氮含量也相应增加，当达到一定程度后反应又会受到一定抑制，导致氨基酸态氮含量降低。图6底部的等高线形状为圆形，图5和图7底部的等高线形状为椭圆形，表明酶解温度与酶解时间之间交互作用不显著，而酶解温度与酶解pH、酶解pH与酶解时间交互作用显著，该结果与方差分析结果保持一致。

表3 回归模型的方差分析

图5 酶解温度和酶解pH交互作用对蟹味菇酶解结果的影响

图6 酶解温度和酶解时间交互作用对蟹味菇酶解结果的影响

图7 酶解pH和酶解时间交互作用对对蟹味菇酶解结果的影响

通过对回归方程进行分析，得到模型的极点值，即酶解温度57.73 ℃、酶解pH 5.82、酶解时间5.92 h，此时氨基酸态氮含量达到最大值（5.824 08 g/100 mL）；考虑到实际操作，对上述优化条件进行修正：酶解温度58 ℃、酶解pH 6.0、酶解时间6 h，并重复3次进行验证试验，测得氨基酸态氮平均含量为5.81 g/100 mL。

3 结论

在单因素试验的基础上，应用Design-Expert 8.0进行方差分析优化蟹味菇酶解工艺条件。结果表明：酶解温度、酶解pH、酶解温度与酶解pH交互作用、酶解pH与酶解时间交互作用及各因素二次方对水解产物氨基酸态氮含量均有显著影响。

回归分析和验证试验结果表明响应面法优化蟹味菇酶解工艺条件切实可行，所得最佳酶解条件为风味蛋白酶用量2%、酶解温度58 ℃、酶解pH 6.0、酶解时间6 h，测得氨基酸态氮含量为5.81 g/100 mL。此次试验为蟹味菇的后期加工利用提供理论依据。