Klotho在急性肾损伤诊断和治疗的研究进展

王 喆 综述 姜埃利 审校

急性肾损伤(AKI)是以肾功能的迅速恶化为特征的临床常见疾病。10%～15%住院患者存在AKI，重症监护室中AKI的患病率超过50%[1]。持续恶化的AKI增加住院率、慢性肾脏病(CKD)、终末期肾病(ESRD)及死亡风险，同时AKI增加卒中、心血管疾病、上消化道出血等风险，严重影响患者的生活质量[2]。因此，需要可靠的生物学标志物早期诊断AKI，早期治疗，进而减轻肾脏损伤。此外，肾脏组织具有一定的修复能力，需要深入了解相关机制，采用新的治疗方法促进肾脏功能的恢复，改善患者预后。Klotho主要来源于肾脏，以往研究多关注Klotho对慢性肾脏病矿物质和骨异常的调节作用。近年来研究发现，Klotho在AKI早期呈现特征性变化，诊断AKI的敏感性和特异性优于传统标记物，可能成为AKI早期诊断的新型生物学标记物。同时，体内和体外研究均发现Klotho在不同病因导致的AKI中均存在肾保护作用，可能成为AKI治疗的新靶点。本文综述Klotho在AKI诊断和治疗中的研究进展。

Klotho的来源和生物学作用

Klotho发现于1997年，是一种抗衰老基因，位于染色体13q12。Klotho主要表达于肾远曲小管，其次是近曲小管，也表达于脑、胰腺、甲状旁腺等器官。Klotho有膜型和分泌型两种形式。膜型Klotho是其基因编码的130 kD单次跨膜蛋白。蛋白酶可以裂解Klotho的部分细胞外结构域，产生分泌型Klotho。分泌型Klotho也来自于可变剪接。分泌型Klotho释放到血液循环成为可溶性Klotho。可溶性Klotho作用于骨骼、脑、心脏、肺、内皮细胞等多种远端器官。Klotho可以结合成纤维细胞生长因子(FGF)受体1，增加FGF23与其受体的亲和力，抑制肾脏对磷的重吸收，促进尿磷排泄。Klotho直接促进肾近曲小管钠磷协同转运蛋白的内化和降解，增加尿磷排泄。Klotho还具有多种生物学作用：抗氧化应激、抗衰老、抗凋亡，以及上调自噬[3]。

对AKI的诊断价值

现有诊断AKI的血、尿生物标志物血清肌酐(SCr)是诊断AKI常用的生物标记物，但是它受年龄、性别、肌肉含量、饮食情况、药物、残余肾功能等因素影响，诊断AKI的敏感度和特异度均较低[1]。目前文献报道的AKI早期诊断的生物标记物包括：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子1(KIM-1)和白细胞介素18(IL-18)[4]。大型前瞻性多中心研究发现，血浆NGAL、尿液NGAL、尿液KIM-1和尿液IL-18诊断AKI的ROC曲线下面积均<0.77[5-6]。因此，我们亟需可靠的生物标记物对AKI进行早期诊断和评估预后。

血浆和肾脏Klotho在AKI早期诊断的应用多项研究分析了Klotho在不同病因AKI的表达情况，并探讨Klotho对AKI的诊断价值(表1)。Hu等[7]建立小鼠的肾缺血再灌注损伤(IRI)的AKI模型。术后第1天和第2天，肾脏Klotho蛋白质和mRNA均降低。术后第7天，肾脏、血浆、尿液Klotho水平与阴性对照组接近。血浆和肾脏Klotho水平在IRI后1h升高，3h后迅速降低。血浆和肾脏NGAL水平在IRI后5h才开始升高。因此，Klotho可能是肾损伤的最早期的生物标记物。王顺等[8]将重症监护病房的患者分为AKI组和非AKI组，AKI组患者基线血清Klotho水平低于非AKI组。血清Klotho早期诊断AKI 的曲线下面积为0.945，临界值为1.76 μg/L，敏感性92%，特异性94%，其敏感性高于NGAL，特异性相近。Seo等[9]分析不同病因AKI患者的肾脏Klotho水平，其与SCr水平呈负相关，组织学检查显示Klotho低值组肾损伤较重。Liu等[10]观察了心脏瓣膜置换术后的AKI患者，术后0h血清Klotho预测AKI的ROC曲线下面积为0.806，临界值是119.145 U/L，敏感度和特异度分别为0.895、0.572。SCr和胱抑素C诊断AKI的ROC曲线下面积分别为0.875和0.742。Klotho诊断AKI的特异度及敏感度均高于SCr，敏感度高于NGAL。Seibert等[11]研究结果不同于以往研究，人体非手术相关AKI中，急性肾损伤网络(AKIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的血Klotho分别为485.3 pg/ml、432 pg/ml、748.4 pg/ml，AKIN分级越高、估算的肾小球滤过率(eGFR)越低，血清Klotho越高。可能该研究没有在肾损伤早期检测Klotho，错过了血清Klotho的下降期，但是在临床工作中，很难确定非手术相关肾损伤的检测截点。AKI病因差异也可能影响Klotho表达。尿液中Klotho能预测AKI，Qian等[12]评价了尿液Klotho对心脏术后AKI的预测作用，AKI患者术后0h尿液Klotho高于非AKI患者。尿液Klotho诊断AKI的曲线下面积为0.86，临界值是0.86 ng/μmol，敏感度93.9%，特异度75.9%。AKI 2期和3期患者尿液Klotho水平高于1期。AKI 2期和3期患者尿液Klotho持续升高7d。肾功能未恢复的患者尿液Klotho高于肾功能完全恢复的患者。Klotho蛋白表达于刷状缘的顶端，AKI中近曲小管上皮细胞刷状缘被破坏消失，这可能导致AKI早期尿液Klotho急剧升高。随着AKI的进展，肾小管上皮细胞坏死和脱落，Klotho随之脱落，导致AKI中尿液Klotho的持续升高，尿液Klotho增加可能提示肾小管损伤的严重程度。因此，尿液Klotho可能成为早期诊断AKI的生物标记物，并且预测心脏术后短期肾功能。但是该研究结果与Hu等[7]的研究矛盾。Hu等[7]发现AKI患者尿液Klotho低于健康对照组。研究结果的差异可能是尿液标本预处理和采集时间不同。尿液中的Klotho不稳定，反复冻融会降低Klotho的浓度[13]。AKI患者尿液Klotho持续升高7d，采集时间过晚会导致结果差异。此外，AKI病因不同也可能影响研究结果，Qian等[11]研究对象是心脏术后AKI患者，而Hu的研究中AKI病因包括脓毒症、高血压、慢性肾脏病、肾毒性药物相关的肾损伤等。不同的检测方法、样本量较少也会造成结果差异。

表1 Klotho在AKI中的变化特点和诊断价值

尿液Klotho鉴别肾性AKI和肾前性AKI Kim等[14]认为尿液Klotho水平可能有助于鉴别肾性和肾前性AKI。肾性AKI组的尿液Klotho显著高于肾前性AKI组。肾前性AKI组的肾组织接近正常，或轻度刷状缘脱落。肾性AKI组刷状缘明显脱落，大量肾小管显著扩张，细胞核消失，间质炎症渗出。肾性AKI组的组织损伤指数显著高于肾前性AKI组。肾前性AKI组的肾脏Klotho表达明显低于肾性AKI组。

肾保护作用的机制以及潜在治疗靶点

Klotho在不同病因导致的AKI中均表现肾保护作用，维持肾脏组织形态和结构，通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡等作用改善肾功能，可能是AKI治疗的新靶点(表2)。

表2 Klotho在AKI中肾保护作用的机制以及潜在治疗靶点

缺血再灌注损伤肾脏缺血再灌注损伤包括肾脏缺血性损伤和再灌注损伤，氧自由基形成，内皮细胞损伤，血管渗透性增加，中性粒细胞、血小板、细胞因子和补体系统活化，造成急性肾损伤(图1A)，多见于肾移植、心脏手术、脓毒症等[15]。氧自由基引发肾小管上皮细胞的程序性坏死，参与肾缺血再灌注损伤的病理生理过程。在IRI导致AKI的动物模型中，肾小管细胞出现细胞程序性坏死，伴随氧化应激反应，血清和肾脏Klotho降低，尿液Klotho升高，Klotho治疗可以降低细胞程序性坏死的标志物[受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)、IL-1β和TUNEL阳性细胞]。Klotho降低8羟基脱氧鸟苷(u-8-OHdG)、肾脏的丙二醛(MDA)和3-硝基酪氨酸，增加超氧化物歧化酶(SOD)和含锰的超氧化物歧化酶(SOD2)。提示Klotho具有抗氧化应激作用，并抑制肾小管细胞的程序性坏死[17]。我国的一项研究中，Klotho 治疗组SCr和尿素氮低于对照组，血清一氧化氮(NO)升高，肾组织过氧化物酶含量减少， SOD增多，推测Klotho 肾保护作用与其抗氧化作用相关，也可能通过增加NO含量扩张肾脏血管及改善肾脏血供[17]，Klotho激活叉头转录因子(FOXO)，FOXO激活促进多种抗氧化基因的表达，包括过氧化氢酶、SOD2，发挥抗氧化作用[18](图1A)。

图1 A:IRI导致AKI的机制;B:Klotho在AKI中的肾保护作用[26]IRI:肾缺血再灌注损伤；AKI：急性肾损伤；NO：一氧化氮；FOXO：叉头转录因子；SOD2:超氧化物歧化酶2

Hu等[7]建立鼠AKI模型，与野生型组比较，Klotho转基因组的肾组织损伤评分显著降低，肌酐清除率并不高于对照组，说明Klotho过表达不增加肾小球滤过率。NGAL是已知的肾保护物质，给予外源性NGAL可以缓解肾IRI，促进细胞再生和组织修复，上调内源性肾脏NGAL mRNA和蛋白质，这可能是Klotho改善肾IRI的潜在机制[19]。

重组α-Klotho减轻氧化应激、增加NO，抑制肾小管细胞程序性坏死，抑制炎症因子，上调内源性NGAL表达，减少肾小管上皮细胞刷状缘的脱落，增加内源性Klotho表达，改善肾功能[7,20-24]。在IRI的AKI模型中[25]， 连续4d给予重组α-Klotho后，肌酐清除率和内源性血浆α-Klotho升高，α平滑肌肌动蛋白降低，提示α-Klotho可抑制肾脏纤维化。早期、短期使用重组α-Klotho可持续改善肾功能和结构，防止AKI向CKD进展。

Klotho治疗时机影响AKI的预后。在IRI后30 min注射Klotho，肾组织损伤减轻，改善肾小球滤过率，疗效优于60 min时内给药，早期治疗更利于改善预后[7]。

化学药物相关AKI 肾毒性药物促进肾小管上皮细胞坏死和凋亡，激活炎症反应、氧化应激和自噬，导致肾损伤[27]。在顺铂导致的AKI中， Klotho降低肾脏细胞表达阳离子转运体2(OCT2)，同时降低OCT活性，减少细胞摄取顺铂。Klotho调节Bax/Bcl-2和caspase-3信号级联反应，产生抗凋亡作用，独立于抗顺铂摄取作用[20]。Oh等[21]采用碘帕醇建立AKI模型， AKI组的Klotho mRNA和蛋白质低于对照组，氧化应激和凋亡指标升高。重组Klotho通过抑制氧化应激和凋亡减轻碘帕醇导致的AKI。

脓毒症性AKI 脓毒症通过缺血再灌注损伤、炎症反应、微循环功能障碍、线粒体损伤和代谢改变，造成肾损伤[28]。Klotho的缺乏加重了脓毒症和多器官功能障碍。在Klotho单倍体不足的杂合子鼠及其同窝幼鼠中建立脓毒症模型，Klotho缺乏组生存率较低，存在肾损伤、肝损伤、氧化应激反应加重，炎症介质和核子因κB(NF-κB)活性增加，交感神经活性减弱，心率变异性减低，对硝普钠的压力反射功能降低，提示Klotho缺乏加重脓毒症和多器官功能障碍[29]。陈薪薪等[30]发现脓毒症小鼠AKI肾组织中Klotho减少、自噬增强，两者均具有时间依赖性。重组Klotho能缓解肾损伤，恢复肾脏内源性Klotho表达。但是，重组Klotho没有影响肾组织表达自噬标记物(LC-3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62)，说明重组Klotho可能没有增加自噬，Klotho的肾保护作用可能与其他机制相关[22]。孙敏等[23]发现，Klotho治疗组肾小球和小管上皮细胞水肿减轻，小管腔内透明管型减少，血清肌酐和尿素氮下降，线粒体结构相对完整，线粒体氧化应激因子下降。肾组织Klotho蛋白、Bcl-2表达升高，细胞色素C下降，提示Klotho蛋白可以维持线粒体结构完整，抑制氧化应激反应，保护肾功能。

Liu等[24]发现Klotho具有抗氧化应激和炎症调节作用。在脂多糖(LPS)建立鼠的脓毒症AKI模型中，肾脏α-Klotho降低。给予外源性α-Klotho后，血清肌酐和NGAL降低，提示α-Klotho能够减轻AKI，α-Klotho高剂量组肾脏恢复更明显。α-Klotho持续降低氧化应激标记物(丙二醛、活性氧自由基、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶和NO)，活化内质网应激的标记物[(葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和XBP1]，降低IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子α，升高IL-10，说明α-Klotho抑制促炎因子，刺激抗炎因子，调节机体内环境。

横纹肌溶解导致AKI 横纹肌溶解后大量肌红蛋白进入血液循环，阻塞肾小管，伴随炎症反应和氧化应激，引起肾小管上皮细胞坏死和凋亡，导致肾损伤[31]。在横纹肌溶解相关的AKI的模型中，肾小管上皮细胞出现程序性坏死，尿液外泌体(uEVs)含有Klotho，uEVs治疗降低血尿素氮和肌酐，降低肾损伤标志物[NGAL、纤溶酶原激活物抑制剂、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和SOX9]，降低促炎因子(肿瘤坏死因子-α，IL-1β和IL-6)。uEVs中的miRNA通过uEVs转运到肾组织，抑制启动子甲基化，参与上调Klotho，恢复正常的Klotho水平。uEVs参与上调Klotho，补偿内源性Klotho，改善肾小管上皮细胞的程序性坏死，促进了肾小管细胞的增殖，降低炎症标记物。外泌体是天然来源的物质，在血液循环中稳定性较高，可以通过工程学的方法转运分子，可能成为理想的治疗方法。来自健康人的uEVs可能是囊泡的新来源，具有促进再生的特性，影响Klotho的调节[32]。

Klotho基因治疗可以改善肾组织损伤和细胞凋亡，降低SCr[33]。采用基因转染技术获得高效表达Klotho 基因的骨髓间充质干细胞，过表达Klotho 基因上调肾脏血管内皮生长因子，减轻肾脏损伤，促进肾功能恢复[34]。

展 望

AKI导致Klotho可逆性的降低，低水平的Klotho加重肾损伤。Klotho具有抗炎、抗氧化应激、抗纤维化、抗凋亡等多种生物学功能,促进AKI后肾脏结构和功能的恢复。故Klotho是AKI的早期生物标记物，可以保护肾功能，是潜在的治疗靶点。

由于血清和尿液Klotho在AKI后的达峰和持续时间不同，需要在肾损伤后进行连续性评估，明确AKI进程中血清和尿液Klotho随时间变化的规律，从而确定标本采集时间。需要通过长期随访的临床研究评价血清和尿液Klotho水平对AKI的预测价值。