PTC3和PPM抑菌剂对橡胶树组培中常见污染菌的抑菌效果及对橡胶树次生体胚发生效率影响

成镜 李季 戴雪梅 徐正伟 周权男 黄天带 黄关青

(中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地−海南省热带作物栽培生理学重点实验室/热带林木种子种苗工程中心海南海口571101)

巴西橡胶树（Hevea brailiensis）是大戟科（Euphorbiaceae）橡胶树属（Hevea）多年生异花授粉乔木，广泛种植于热带地区。其所产生的胶乳是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位［1］。橡胶树种苗从传统的种子苗发展到芽接苗，再到目前的橡胶树组培苗（橡胶树自根幼态无性系）。橡胶树组培苗是通过花药和内珠被等外植体进行胚性愈伤组织诱导和体细胞胚发生获得初生体胚，再以初生体胚为外植体，通过胚到胚的循环次生体胚发生繁殖体细胞胚，最后诱导次生胚植株再生来获得［2］。

在橡胶树组织培养过程中，污染问题一直伴随着组织培养过程，污染率的高低不仅影响植株组织培养的效率，更影响组培苗生产成本的高低。PTC3（Plant Tissue Culture Contamination Control）和植物组培抗菌剂（Plant Preservative Mixture， PPM）是一种广谱抗微生物剂，可以杀死细菌和真菌细胞，防止真菌孢子的萌发，并在较高浓度下能消除内源性污染的外植体。PPM 应用于甘薯试管苗的移栽炼苗过程，对甘薯试管苗炼苗期的培养基防污染有一定抑制效果［3］。

针对橡胶树组织培养过程中存在的污染问题，很多学者进行过相关研究。秦云霞等［4］发现苯甲酸钠和山梨酸钾以及益生菌哈茨木霉菌株13-3-2可以用于降低污染率。添加3%的苯甲酸钠或山梨酸钾的培养基可有效防止细菌及部分真菌（包括黑曲霉）污染；在后期驯化练苗过程中，接种的哈茨木霉菌13-3-2 可有效杀死多种污染真菌，使污染苗的成活率提高43%以上。另外使用40%福星乳油对粗糙脉孢霉菌的抑制效果最好，其EC50最小；其次为70%甲基托布津可湿性粉剂；50%扑海因可湿性粉剂，99%恶霉灵可湿性粉剂，50%敌磺钠可湿性粉剂对其的杀菌效果均一般，50%多菌灵可湿性粉剂无效［5］。黄天带等［6］为了降低橡胶树带芽茎段的污染率，使用1 g/L 多菌灵和800 mg/L羧苄青霉素钠、500 mg/L噻孢霉素混合后处理外植体，真菌污染率下降了55.29%，细菌污染率下降了4.58%。

姜泽海等［7］为了降低大田中橡胶树新生树根的污染率，在常规消毒前先采用1 g/L 多菌灵对外植体处理2.5 h，再用75%乙醇消毒30 s 及0.1%HgCl2消毒6 min，然后接种到添加0.1%益培隆的固体愈伤诱导培养基上，培养30 d 后外植体污染率下降至44.59%，存活率达25.60%。

以上研究的对象分别为完整的橡胶树组培苗、带芽茎段、橡胶树新生跟，研究阶段为植株再生阶段、启动培养阶段、愈伤诱导阶段，而没有对橡胶树次生体胚发生过程中存在的污染及其对次生体胚发生效率的影响进行研究。本研究旨在通过使用2种新型的抑菌剂研究其对橡胶树次生体胚发生过程中存在的污染的防治效果及其对次生体胚发生效率的影响，以便为后期橡胶树组培苗生产提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

植物组培抗菌剂PTC3（品牌：PhytoTechnology，北京西美杰科技有限公司）和植物组培抗菌剂（Plant Preservative Mixture， PPM）PPM（上海翊圣生物）。

红青霉菌是从污染的平板上分离并进行形态和测序鉴定。污染平板来自于本单位橡胶树组培苗生产工作室。

橡胶树次生体胚发生的材料和方法参考华玉伟等［2］方法。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因组DNA提取方法及ITS序列扩增

除了进行形态鉴定外，还克隆所分离污染菌的tef1 序列，系统进化分析从而鉴定其类别。以CTAB 法提取病菌的基因组DNA，以真菌通用引物Ef728 （5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'） 和Tefla（5'-GCCATCCTTGGGAGATACCAGC-3'） 为 引 物 进 行PCR 扩增。经过PCR 产物回收、连接、转化及菌落PCR 鉴定后送公司测序。登录NCBI，将所得序列进行序列相似性比对，并下载相应基因序列，用lasergene软件进行对位排列，构建分子系统树。

1.2.2 两种抑菌剂不同浓度对菌株生长的影响

取经28˚C 培养4 d 的菌株，加5 mL 无菌水洗下霉菌孢子，依次10 倍稀释为10−3，使孢子数约为103个/mL。分别取0.2 mL 孢子悬浮液与20 mL LDA培养基混匀到平板，28℃遮光培养48 h 后备用。在配制1/2 PDA+5 g 酵母粉固体培养基时，分别加入PTC3和PPM2 种抑菌剂，使其浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL/L 和0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95 mL/L的含药培养基，对照为不加药的培养基，高温高压灭菌备用。用打孔器（直径10 mm）从备用平板中打取菌饼（将培养好的病原菌，在无菌条件下用直径10 mm 的无菌打孔器，自菌落边缘切取菌饼，用接种器将菌饼接种于含药平板中央，菌丝面朝下，盖上皿盖，置适宜温度的培养箱中培养。），菌丝面朝下接种于含药培养基中央，每个平板加一个菌饼，3 次重复，28℃遮光培养，每2天取出测量菌落直径（用卡尺测量菌落直径，单位为mm。每个菌落用十字交叉法垂直测量直径各一次，取其平均值。）

生长抑制率=［（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）］/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%

1.2.3 不同抑菌剂浓度对橡胶树次生体胚发生的影响

分别设置PTC3浓度（0.2、0.4、0.6、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL/L） 和PPM 浓 度（0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95 mL/L），每个浓度为一个处理，每个处理接种10 皿，每皿接种7 个胚块外植体，重复3 次。所用培养基采用华玉伟等文献［2］中的培养基，在25℃下，暗培养30 d 后，统计污染情况、出胚愈伤数、正常胚愈伤数。

1.2.4 数据统计与分析

数据统计使用Excell 2003 软件，序列比对和系统进化树分析使用Lasergene软件。

2 结果与分析

2.1 分离及鉴定橡胶树组培的超强污染源

根据污染源出现的频率和污染源在培养基上的表型，挑取了组培中常见的污染源进行分离接种，命名为y3。tef1 扩增片段大小约为610 bp，利用NCBI blast 进行序列比较，发现序列相似性为98%～100%。下载同源基因的fasta 序列，利用软件Lasergene 软件进行序列比对分析，采用Neighbor-Joining 方法进行聚类分析，进行1 000次bootstrap 统计学检验，结果显示，y3 与Penicillium rubens红青霉归为一类（图1）。

图1 污染真菌ITS 序列的进化分析

2.2 两种抑菌剂对污染菌的拮抗作用。

从表1 中可以看出，培养2 d，当PTC3抑菌剂浓度为1.0 mL/L 时，对真菌的生长抑制率为18.1%。随着浓度的增加，生长抑制率逐渐降低。培养5 d 时，PTC3抑菌剂浓度为1.6 mL/L 时，对真菌的生长抑制率为22.3%。随后，随着抑菌剂浓度的增加呈滑坡势下降。

表1 PTC3对菌株生长抑制率的影响

从表2 可以看出，培养2 d 时，PPM 抑菌剂浓度为0.6、0.65、0.7、0.85、0.95 mL/L 时，对真菌的生长抑制率分别为18.6%、17.4%、17.2%、19.2%、16.3%。培养5 d 时，所有抑菌剂浓度处理对真菌均没有生长抑制作用。

2.3 不同抑菌剂浓度对橡胶树次生体胚发生效率的影响

从表3 可以看出，随着PTC3抑菌剂浓度的增加污染率呈下降趋势。出胚率随着抑菌剂浓度的增加呈先下降，后缓慢增加的趋势。正常胚率随着抑菌剂浓度的增加有逐渐增加的趋势。有效率随着PTC3抑菌剂浓度的增加呈逐渐升高再降低的趋势。当PTC3抑菌剂浓度为1.6 mL/L 时，污染率为10%、出胚率为30%、正常胚率为20.0%、有效率为7.3%。与对照（CK）相比，污染率降低了36.7%、出胚率降低了14.6%、正常胚率增加了14.7%、有效率增加了6.4%。

表2 PPM对菌株生长抑制率的影响

表3 PTC3对橡胶树次生体胚发生效率的影响

从表4 可以看出，污染率随着PPM 抑菌剂浓度的增加呈逐渐降低的趋势，出胚率、正常胚、有效率随着PPM抑菌剂浓度的增加呈先升高再降低的趋势，当PPM 抑菌剂浓度为0.65 mL/L 时，污染率为9.3%、出胚率为33.6%、正常胚率为7.4%、有效率为2.8%。与对照（CK）相比污染率降低37.4%、出胚率增加18.1%、正常胚率降低了1.9%、有效率增加了1.9%。

表4 PPM对橡胶树次生体胚发生效率的影响

3 讨论与结论

植物组织培养中，污染问题一直是伴随着组织培养发生的，培养过程中，培养室空气质量、起始培养材料、灭菌程序、无菌操作、培养容器的密封情况等因素都会引起组培过程中污染的发生。本研究通过单菌分离及分子鉴定结果表明：红青霉菌是橡胶树组织培养中常见的污染菌。

从PTC3和PPM 抑菌剂对红青霉菌的生长抑制率来看，PTC3的抑菌效果较PPM 稍好。但总体上2 种抑菌剂对红青霉菌的生长抑制率较低，培养2 d，当PTC3抑菌剂浓度为1 mL/L时，对真菌生长抑制率为18.1%。培养5 d，PTC3抑菌剂浓度为1.6 mL/L时，对真菌生长抑制率为22.3%。培养2 d 时，PPM抑菌剂浓度为0.6、0.65、0.7、0.85、0.95 mL/L时，对真菌的生长抑制率分别为18.6%、17.4%、17.2%、19.2%、16.3%。培养5 d 时，所有浓度处理均没有抑菌效果。2 种抑菌剂对红青霉菌的生长抑制率均较低，可能是因为所使用的浓度均较低。在今后的研究中应该增加这2 种抑菌剂的使用浓度。

从2种抑菌剂对橡胶树次生体胚发生效率的影响研究发现，当PTC3抑菌剂浓度为1.6 mL/L时，污染率为10%、出胚率为30%、正常胚率为20.0%、有效率为7.3%。与对照（CK）相比，污染率降低了36.7%、出胚率降低了14.6%、正常胚率增加了14.7%、有效率增加了6.4%。当PPM 抑菌剂浓度为0.65 mL/L 时，污染率为9.3%、出胚率为33.6%、正常胚率为7.4%、有效率为2.8%。与对照（CK）相比，污染率降低37.4%、出胚率增加18.1%、正常胚率降低了1.9%、有效率增加了1.9%。

在组织培养中，控制污染是要亟待解决的问题，但是，不能因为使用抑菌剂对植物材料的生长产生不良影响。从2种抑菌剂对橡胶树次生体胚发生效率的影响来看，PTC3和PPM 均有降低污染率和促进体胚有效率增加的作用，PTC3相对于PPM 的效 果 稍 好 一 些。为 探 究 烟 草［8］、白 菜［9］、蓝莓［10］、马铃薯［11-12］铁皮石斛［13］开放式组织培养中抑菌剂对组织培养的影响，使用了卡那霉素、头孢霉素、多菌灵和次氯酸钠、生物农药大蒜素与化学农药代森锰锌、50%多菌灵可湿性粉剂、70%代森猛锌可湿性粉剂、YI-1、57.6%冠菌清干粒剂、50%扑海因悬浮剂、75%百菌清可湿性粉剂、组菌清、植培灵、菌杀光、甲基托布津等抑菌剂，效果因物种和抑菌剂组合和使用浓度而异。除了在商业化组织培养中使用抑菌剂，在茶树［14］转化体系中使用2种抑菌剂表明，头孢噻肟钠和羧苄青霉素明显降低茶树外植体的成活率和增殖率，且呈浓度依赖效应；低浓度特美汀（对茶树外植体的生长和增殖都没有明显影响，并能完全抑制发根农杆菌的生长，故特美汀在茶树遗传转化中的应用有望提高茶树的遗传转化效率。所以在使用抑菌剂的同时应该考虑对外植体生长的影响，否则就会本末倒置，得不到理想的结果。在组织培养过程中，污染菌并不是单一的菌种，可能是由一种或多种菌组成，所以，在今后的研究中应该将抑菌剂进行组合应用，这样防治污染的效果可能会更好。另外，为了不对植物组织培养过程产生不良影响，应使用安全、专一、植物源的抑菌剂。

植物组织培养已广泛应用于农业、林业、医药、化工等领域，在组培中存在经费投入多、能源消耗量大、无菌操作需要大量技术人员等现状。为了进一步降低组培成本、简化生产工艺，在组培环节中应考虑在外植体消毒、培养基支撑物替代与循环利用、应用抗菌剂和抑菌剂抑制培养基及培养物污染、采用自然光照和大棚温度来代替组培日光灯光照等方面进行探索和研究，为降低植物组织培养生产成本、节能降耗提供理论支撑［15］。