药用植物防治罗非鱼链球菌病的研究进展

李健 许昌有 张诗泽 牛志凯 张陆军 董博 魏文康1,

(1 广州市众望饲料有限公司 广东广州510540;2 深圳市科芙海洋科技有限公司 广东深圳518124;3 广东省农业科学院农业生物基因研究中心/广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室广东广州510640)

罗非鱼链球菌病是一种恶性的传染病，发病快且传染性强，可导致鱼类出现多种生理病变，严重时可致死亡，对世界水产行业造成了巨大的经济损失。病原链球菌主要包括化脓性链球菌、草绿链球菌、肺炎性链球菌和无乳性链球菌。其中无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和海豚链球菌（Streptococcus irriae）是2 种主要病原菌［1-3］。无乳链球菌是革兰氏阳性菌，表面光滑湿润并略显凸起，边缘比较整齐，呈圆形，乳白色，显微镜下可见一个或者多个球形或链状菌体。鱼体感染致病性链球菌后，表现功能异常、眼巩膜白浊和体表出血等特征，通常致死率较高［4］。常规治疗罗非鱼链球菌病的方案中，生态防治对水质影响较大，抑制了鱼类的生长。抗生素易残留，导致抗药性，不可长久使用。疫苗注射不易操作，首次注射的疫苗活性不稳定，导致实用性大大降低［5-6］。目前，临床上亟待低残留、无耐药性和副作用的药品。

药用植物或中草药具有天然性强、成本低廉、种类繁多、来源广泛、毒副作用微弱、不易产生耐药性等优势［7-9］。无论是外部环境还是鱼体内部，中草药不仅易吸收降解，而且能够起到增强免疫力和抗菌杀毒的作用。将中草药应用于治疗罗非鱼早期病毒感染，治愈率较高，能够最大限度地降低病菌感染，使水产品质量得以保障［10-12］。现代医学探究可知，黄柏、大黄、穿心莲等中成药具有清热解毒的功效，在抗菌方面作用显著。另外，具有补虚、止血、活血、祛湿、泻下等作用的药物同样具有抗菌杀毒的作用［13-14］。与传统治疗方式相比，中成药在广谱抗菌方面优势明显，多种中草药及其复方能够调节机体免疫力，使体内微生态趋于平衡，以提高抗病毒的能力。因此，中药防控罗非鱼链球菌病意义重大。

1 用于防治罗非鱼链球菌病的主要药用植物及其主要成分

1.1 溪黄草

溪黄草（Herba Rabdosiae Serrae）是民间草药，具有清热利湿、退黄祛湿、凉血散癖的作用。何春兰等［15］研究发现，溪黄草晒干品水提物与醇提物的杀菌效果相比，后者的效果更优。溪黄草晒干后的水提取物能够高效杀灭鼠伤寒沙门氏菌、蜡状芽抱杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等病菌。溪黄草晒干后的醇提物、阴干品醇提物以及水提物对蜡状芽抱杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病菌有较好的灭杀功效。

1.2 五倍子

五倍子具有非常复杂的药理活性，其含有的活性成分主要有五倍子鞣质和原药中或通过水解得到的没食子酸。五倍子中含有的其他成分也有抗菌活性，只是效果甚微。在进行体外实验时，将五倍子磨成粉或者制成浸液施用于链球菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、牙周细菌、蜡状芽抱杆菌、炭疽、痢疾、白喉、伤寒、副伤寒、绿脓杆菌等，可以发现五倍子有较强的抑菌杀毒功效，其作用机制可能是鞣质使微生物体内的原生质凝固［16］。

1.3 苦参

苦参（Radix Sophorae Flavescentis）为豆科槐属植物，整株煎汁有杀虫的功效，内服后可驱虫、健胃、治疗赤痢等症，其种子具有明目的功效，根部具有杀虫、祛风、除湿、利尿、清热等功效［17］。苦参碱能够阻抑角肮细胞的生长，增强机体免疫力，还具有抗炎的功效。苦参能够有效抑制金色葡萄球菌、痢疾杆菌、白痢沙门氏杆菌等多种病菌，而且能够抑制十几种皮肤真菌，如瑾色毛癣菌等［18］。

1.4 鸡血藤

鸡血藤是豆科植物密花豆的干藤茎，其药效主要表现为：抵抗氧化、炎症、病毒、肿瘤等，增强自身免疫系统，镇静催眠［19］。前期研究表明，鸡血藤对罗非鱼无乳链球菌病有显著的疗效［20］。

1.5 诃子

西青果为诃子的干燥幼果，俗称藏青果，主要是运用其活性成分鞣质来破坏病菌的细胞壁，以达到抑菌杀毒的功效［21］。诃子对多种菌株都具有抑制作用，如金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、沙门伤寒杆菌、绿脓假单胞菌、克雷伯杆菌、抗表皮葡萄球菌等［22-23］。

1.6 丹参

试验表明，丹酚酸和丹参酮是丹参中含有的主要化合物，无乳链球菌能够被丹酚酸和丹参酮高效灭杀［24］。梁勇等［25］研究发现，二氢丹参酮及隐丹参酮对葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌有高效的灭杀功效。提取含有丹参醇的药液对以下病菌具有抑制作用：铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌、短小芽胞杆菌、黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌等［26-27］。

1.7 水翁花

水翁花药用部分为花蕾，其中的挥发油和其它有机提取物是水翁花中含有的主要抗菌成分。挥发油通过凝结细胞质的方式，破坏细胞中的蛋白质和脂质，致使大分子物质从细胞中泄露出来，导致细菌的裂解灭亡［28］。水翁花对无乳链球菌有明显的抑杀功效，能够有效抑制肠道致病菌以及化脓性球菌［29］。

1.8 石榴皮

对某些常见的病菌来说，含石榴皮的药液具有广谱抗菌的功效，尤其是能够灭杀金黄色葡萄球菌。石榴皮药液能够干扰细菌合成蛋白质，抑制细胞壁形成，细胞壁的通透力因此发生变化［30］，但是其抗菌杀毒的具体病理尚待进一步探究。

抑制链球菌的药用植物主要成分包括生物碱类、黄酮类、菇类、醌类和有机酸类等。另外，中药肠道细菌代谢产物同样有抗菌作用。经过机体肠道厌氧菌分解后，有些中草药的代谢产物表现出明显的抗菌活性。严梅祯等［31］曾指出，黄芩汤不能显著抑制由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染引起的无菌小鼠死亡，但黄芩汤代谢产物则能显著抑制由同样两种病菌感染引起的无菌小鼠死亡。

2 药用植物用于防控罗非鱼链球菌病的现状

中草药含有复杂的成分，可能是单一成分具有抗菌效果，或者是多种不同成分的联合作用［32］。中草药对菌株产生抑制作用的具体方式可能是通过抑制细胞壁上多种合成酶和呼吸酶，阻断生物合成，也可能是通过破坏细胞壁的方式让细胞质流出，致使菌株死亡。中药除了直接的抑菌方式，还可通过增强非特异性和特异性免疫机制来提高鱼类对病原菌的抵抗力［30］。尽管中药提取物对鱼类免疫系统的确切作用机制研究不多，但一般认为来自这些提取物的免疫刺激剂可增强非特异性体液（如细胞因子、防御素、溶菌酶、补体等）［33-34］和细胞防御机制（如TLR/MyD88/NF-κB 信号通路）［35］，恢复微生态均衡，增强机体抗感染的能力。这些机制被认为是抵御入侵病原体的最基本也是第一道防御线［36-38］。另外还有研究表明，药用植物能够修复罗非鱼链球菌病引起的肝脏损伤，显著抑制链球菌感染所造成的吉富罗非鱼肝脏AST 和ALT 上升，提高抗氧化应激能力，减轻链球菌感染引起的病理损伤［39-41］。

2.1 多种药用植物复方筛选

筛选具有抗菌消炎功能的单种中草药，找出抗菌成分，探究其机理，同时，还要进行复方制剂的研制，因为不同抗炎杀菌功效的中草药配制会产生协同作用，而且一般复方效果优于单方。例如，蒋红等［42］在探究中草药对鸡大肠杆菌的抑制作用时选取了4 种中草药（黄柏、甘草、黄芩、大黄），使用复方后抑制鸡大肠杆菌的功效得到提升。梁志凌等［43］测定82种中草药水提物对罗非鱼（Tilapia sp.）无乳链球（Streptococcus agalactiae）的体外抑菌活性时发现，三棵针与以下中草药呈现出协同功效：丹参、红藤、黄连、大黄、苏木、五倍子、石榴皮、夏枯草；黄连与以下中草药呈现出协同功效：苏木、红藤、大黄、丹参；五倍子与以下中草药呈现出协同功效：艾叶、苏木、大黄、虎杖、丹参、红藤、黄连、石榴皮、北五味子。

2.2 药用植物和抗生素复方研究进展

治疗成效显著和治疗周期短是抗生素类药物的主要特点，绿色环保、功能强大、微毒性是中药的主要特点。中西药复方可以弥补二者单独使用的缺陷，兼顾二者的优势，不但能够减少抗生素类药物的用量，还能够防止病原菌产生耐药性，从而降低水产品中的药物残留，有利于水产养殖业持续、稳定、绿色发展［44-47］。胡东良等［48］在对淡水鱼和贝类的常见致病菌进行防治实验时，采用了8 种抗生素类药物、3 种中草药和9 种中西药复方制剂分别进行实验。结果表明，单一的西药或中药只对特定的淡水鱼病菌起到灭杀作用，而9种复方制剂能够高效灭杀贝类和鱼类多数常见的病菌。刘全离等［49］研究还发现，中草药分别与吡哌酸、先锋V进行复配得到的中西医复方，其灭杀耐药病菌的功效要远高于单一抗生素的抑制功效。另外研究发现，单独使用鸡血藤提取液、硫酸链霉素时，二者均无灭菌活性；但是进行复配使用时，其产生的抑菌成分能够损坏细胞膜并增强其通透性，破坏细菌主动排泄中西药复方制剂的系统，从而增加细菌的核糖体、染色体与复方制剂的结合点，产生协同抗菌功效，加速病菌的死亡［50-51］。

2.3 药用植物和益生菌复方研究进展

中草药和微生态制剂的综合应用，可协同提高动物机体的免疫机能、抗病能力以及促进生长。研究发现，中草药制剂对嗜酸乳杆菌、纳豆芽抱杆菌和粪肠球菌等5种益生菌都有较好的体外促增殖作用。多糖、有机酸等这些中草药的活性成分会在益生菌的代谢进程中被加工，由此产生的代谢产物对益生菌的繁殖非常有利。同时饲料中添加中草药和微生态制剂可以改善罗非鱼的肠道菌群结构，促进其生长，提高其抗病能力［52］。由于不能被鱼类直接吸收的中草药种类很多，为了发挥其作用，必须对肠道菌群进行前期处理［53］。肠道细菌在成长代谢时会产生多种酶类，细菌不同产生的酶类不同，作用也有很大差异。β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶等多种消化酶类是肠道细菌在代谢过程中产生的，这些酶类将中草药转化成可被机体吸收利用的物质，对中草药药性的发挥非常重要。从丘金珠等［52］的实验结果可知，罗非鱼在使用中草药微生态制剂和益生菌拌料投喂后，其体内的大肠杆菌数量明显下降。

2.4 多种药用植物体外抗菌敏感性研究

已有许多研究［32，43，54-55］表明，在防治罗非鱼链球菌病过程中，多种中草药发挥出较好的抑制乃至灭杀功效。张彬等［56］对罗非鱼链球菌进行了体外抑菌性实验，实验中选择了10 种不同的单味中草药，分别为黄连、蒲公英、大黄、金银花、黄柏、黄芩、穿心莲、大青叶、龙胆草、连翘，结果显示，这些中草药体外抑菌性较强，其中黄柏、黄连、大黄和黄芩这4种中草药具有较强的抑菌作用，抑制性因链球菌的不同而不同，黄连是海豚链球菌最敏感的中药。进一步探究其机理可知，聚碱、黄连碱、巴马汀等黄连中含有的主要成分可以使病菌的细胞结构破损，通过抑制糖代谢，将抑菌的作用发挥出来。大黄位于单方药物抑菌效果的首位。将中草药两两复配做进一步探究可知，以下2种中药连用可以提高抑菌功效：黄连和黄岑、黄柏和大黄［57］。

除了上述研究，华亚南等［24］在进行抑菌实验过程中选取了230种中草药，其对抑制无乳链球菌效果显著的中草药原液有15 种，效果较好的中草药：西青果、诃子、五倍子、石榴皮；效果次之的中草药：鸡血藤、地榆、水翁花、公丁香、牡丹皮、侧柏叶、丹参；效果较差的中草药：地骨皮、香薷、淫羊草、黄连。

邓恒为等［19］在实验过程中采用的主要研究方法是琼脂扩散法与微孔板法相结合，筛选出在体外抑制链球菌活性效果优良的中草药提取液共计20 种，研究发现，已经感染链球菌的罗非鱼摄入掺了这些原液的饵料后发现，有7种提取液能够有效抑制罗非鱼链球菌病。李一珊等［58］研究发现，能够较好地抑制罗非鱼链球菌的中草药有五倍子和黄连，其中黄连的效果最好，其能够破坏正常无乳链球菌的生长，使病菌的衰退期大大提前，由此达到抑菌作用。

除此之外，某些中草药具有独特的气味，如山碴、艾叶、紫苏、土茯苓，可将其制成诱食剂。它们可以刺激水生物的进食欲望，促进胃肠蠕动以及消化液的分泌，进而提高水生物的生长速度，使得水产业能够高效、安全、增产。

3 展望

中国是养殖罗非鱼的主要国家之一，罗非鱼产业对于中国乃至世界来说意义重大，不仅能够解决粮食短缺问题，提高就业率，还有利于国际贸易的开展。然而链球类病菌对中国罗非鱼养殖业影响严重。为了保障罗非鱼等水产养殖业的持续健康发展，可对其流行病学进行相关调研，如探查、防治等，从中筛选出无残留、不易产生耐药性、效果较好的单方或者复方药用植物，从而研制出能够防治病菌的饲料产品，进而减少养殖业的损失，提高水产品的品质。