基于SRAP标记的不同干形云南松遗传基础研究

何承忠吴治洋沈德周甘沛华周安佩纵 丹

（1.西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650233；2.西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南 昆明 650233；3.西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650233）

云南松（Pinus yunnanensis）是云南省主要森林植被类型，也是云南的先锋造林树种，分布面积占云南省国土面积的29.98%，占全省林地面积的52%，占有林地蓄积的32%[1]，在云南省经济建设、社会发展和生态建设等方面发挥着举足轻重的作用[2]。然而，因为大量云南松造林粗放，良莠不齐，衰退问题突出，有超过2/3的云南松林分中分布有大量扭曲型云南松（树干既扭曲又弯曲），特别在滇中地区的次生林或人工纯林中表现尤为突出[3-4]。由于云南松树干扭曲严重，影响了树体的生长和木材的利用价值，极大地降低了云南松林分的质量[1,5]。干形遗传改良是获得材积增益的主要措施之一，在林木遗传改良研究中占有重要地位[6-7]，而云南松干形发生扭曲现象的生物学机制还不清楚。为此，本研究利用SRAP分子标记技术，对采集于6个居群共180份不同干形云南松进行遗传分析，并将不同干形云南松的特有差异条带进行克隆测序及BLAST功能预测，为今后云南松优良种质资源的早期选择提供可靠的遗传背景信息。

1 材料与方法

1.1 实验材料

直干形和扭曲形云南松样本分别采集于大理州鹤庆县、丽江市玉龙县、大理州剑川县、大理州云龙县、楚雄州永仁县和昆明市禄劝县直干形和扭曲形混杂分布的6个居群，每个居群内采集15株直干形和15株扭曲形（扭角＞20°）云南松的新鲜幼嫩针叶，用变色硅胶快速干燥保存，带回实验室待用。

1.2 实验方法

1.2.1 总DNA提取

将充分干燥后的针叶用冷冻混合球磨仪进行研磨至粉末状，采用HiPure SF Plant DNA Kit提取各样本基因组总DNA；用1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪进行质量检测，并将DNA浓度稀释至50 ng/μL。

1.2.2 SRAP分子标记分析

从180份分析样本中，随机挑选扭曲形和直干形样本各5个，用于SRAP标记引物筛选。共合成208对SRAP引物，采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶法进行PCR产物分离，挑选扩增条带清晰，位点分布均匀，且在扭曲形和直干形样本中条带数目差异较大的引物组合，经荧光标记后，采用毛细管电泳法进行所有样本的SRAP标记分析。毛细管电泳结果表明，扭曲形或直干形云南松具有特有差异条带的引物组合PCR产物，应用6%变性聚丙烯酰胺凝胶法进行PCR产物分离，从中回收特有差异条带用于测序分析。

SRAP扩增反应体系为25 μL，扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，36 ℃退火30 s，72 ℃体延伸90 s，5次循环；94 ℃变性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃体延伸90 s，30次循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。扩增结束后，在PCR扩增产物中加入5 μL溴酚蓝指示剂，短暂离心，95 ℃变性5 min后立即置于冰中待用。6%变性聚丙烯酰胺凝胶预电泳（85 W）30 min后吸取8 μL已变性的选择性扩增产物，（70 W）电泳分离，当溴酚蓝指示剂泳动到玻璃板下沿时停止电泳。电泳缓冲液为1×TBE。参照Tixier等[8]银染法显影，采集SRAP条带。

1.2.3 不同干形云南松特异片段回收及克隆

电泳显影后的聚丙烯酰胺凝胶胶板于室温晾干后，用手术刀片将不同干形云南松特有差异片段切割并从胶板剥离，收集于200 μL离心管。用100 μL ddH2O清洗3次，溶于50 μL ddH2O，10 000 r/min离心2 min，吸收上清液于1.5 mL离心管。取1 μL特异条带回收液作为模板，按照上述体系再次进行PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，挑选条带清晰、无杂带、无污染的PCR产物，参照Takara生物科技有限公司生产的pMD18−T vector试剂盒使用说明书进行连接转化反应。连接转化反应产物应用pMD18−T载体通用引物对单克隆菌液进行PCR扩增，从而进行阳性检测。挑选条带亮，无非特异性扩增的菌液样本，送往昆明硕擎生物有限公司进行测序。

1.3 数据统计与分析

应用GeneMarker V2.2.0软件将毛细管电泳结果的峰值图转化为0/1矩阵，同一位点有峰值则标记为“1”，无峰值标记为“0”。采用POPGENE 1.32软件计算多态性条带数（P），多态带百分率（PPB），观测等位基因数（Na），有效等位基因数（Ne），Nei's基因多样性指数（H），Shannon's信息指数（I），基因流（Nm），遗传分化系数（Gst）及遗传一致度（genetic identity）。采用NTsys 2.10e软件进行不同居群及不同干形云南松的聚类分析，采用AMOVA软件进行主坐标轴分析。将特有差异条带序列应用MEGA 5.0软件进行序列信息分析，剔除pMD18−T载体序列后，将目的片段序列在NCBI和Uniprot网站（https://www.uniprot.org）进行BLAST同源性和相似性对比，查找相似基因和蛋白质及蛋白质功能。

2 结果与分析

2.1 SRAP引物扩增结果

从208对SRAP引物组合中，共筛选出PCR扩增稳定、条带清晰、多态性丰富的引物组合14对。云南松180份样本的14对引物组合毛细管电泳结果显示，共分离得到584条带，其中公共条带33条，多态性条带551条，多态带百分率为94.35%。E−GCC/M−AAT引物组合扩增出的条带数最多，为53条，E−AAC/M−CGG引物组合扩增出的条带最少，为27条，每对引物组合平均扩增条带数为41.7条。多态带百分率变幅在83.33%～98.11%之间，分别对应的引物组合是E−AAT/M−ATA和E−AAC/M−ACC，平均每对引物组合扩增得到多态性条带数为39.4条（表1）。

2.2 遗传基础差异分析

不同干形云南松遗传基础差异分析结果见表2。由表2可知，在物种水平上，云南松180份样本多态带百分率为94.35%，观测等位基因数（Na）为1.948 18，有效等位基因数（Ne）为1.190 9，Nei's基因多样性指数（H）和Shannon's信息指数（I）分别为0.295 7和0.451 4，表明云南松具有丰富的遗传变异基础。

从云南松不同干形水平来看，Na范围为1.683 2～1.861 3，最高者是云龙居群直干形（YS，Na=1.861 3），最低者是鹤庆居群扭曲形（HT，Na=1.683 2）；Ne的范围为1.365 5～1.454 1，最高的是剑川居群扭曲形（JT，1.454 1），最低的是鹤庆居群直干形（HS，1.365 5）；H介于0.218 1～0.268 7，分别为云龙扭曲形HYT=0.268 7，鹤庆直干形HHS=0.218 1；I介于0.332 5～0.410 1，最高的是云龙直干形IYS=0.410 1，最 低 的 是 鹤 庆 直 干 形HIS=0.332 5。扭曲形云南松和直干形云南松的平均多态百分率（PPB）、Na、Ne、H、I分别为94.18和93.57，1.941 8和1.935 7，1.480 0和1.463 9，0.290 0和0.282 9，0.444 0和0.435 5，各项指标中，扭曲形云南松均大于直干形。表明6个居群内的不同干形云南松遗传差异较丰富，且不同居群间的扭曲形云南松遗传变异水平更高。

表 1 SRAP引物组合扩增结果Table 1 The amplified results of SRAP primer combinations

在居群水平上，6个云南松居群的平均多态性条带百分率为92.60%，其中鹤庆居群多态条带最低（90.79%），而云龙居群的多态性条带百分率最高（93.84%）。鹤庆居群的Na、Ne、H、I均为最低值，分别为1.907 9、1.451 6、0.270 3和0.414 4，云龙居群的Na最高，为1.938 4，而Ne、H、I的最大值均出现在剑川居群，分别为1.487 2、0.290 4和0.441 8。以H为指标，从大到小依次为剑川居群＞云龙居群＞丽江居群＞永仁居群＞禄劝居群＞鹤庆居群。

表 2 云南松遗传基础差异比较Table 2 Comparison on genetic variation ofP. yunnanensis

2.3 遗传分化与遗传结构分析

遗传分化系数（Gst）是指居群间的变异与总变异的比值，反映了变异的主要来源；基因流（Nm）反映的是居群间基因的交流程度。利用POPGENE 1.32软件分别计算干形间和居群间云南松的Gst和Nm，结果见图1。以居群为单元，云南松Gst为0.097 3，Nm为4.640 6，表明不同居群间云南松遗传分化较小，基因交流程度高，遗传差异主要发生在居群内不同个体间。以干形为单元，6个居群间的直干形和扭曲形云南松Gst和Nm分 别 为0.157 3和2.678 7；90株 扭 曲 形和90株直干形云南松之间的Gst和Nm分别为0.008 7和56.700 2，2种分析结果均表明，在干形水平上，扭曲形和直干形云南松分化较小，基因交流频繁，遗传差异主要来自于干形内的不同个体间。

图 1 云南松居群水平和干形水平的遗传分化系数和基因流Fig.1GstandNmofP. yunnanensisat the levels of populations and stem forms

2.4 遗传相似系数与聚类分析

居群间不同干形云南松的遗传相似系数处于0.886 3～0.968 4（表3），云龙居群扭曲形（YT）与直干形云南松（YS）之间遗传相似系数最高，而禄劝居群扭曲形云南松（QT）与鹤庆居群扭曲形云南松（HT）之间遗传相似系数最低。从两两之间遗传系数来看，禄劝居群扭曲形云南松（QT）与其他居群2种干形云南松之间的遗传相似系数较低，尤其与鹤庆居群扭曲形（HT）、直干形（HS）、永仁居群扭曲形（RT）的遗传相似系数均低于0.9，表明禄劝居群扭曲形云南松（QT）与其他居群云南松遗传相似程度低，亲缘关系较远。而云龙居群直干形（YS）与其居群扭曲形，以及其余居群云南松之间的遗传相似系数均高于0.9，且与剑川居群扭曲形（JT）和直干形（JS）、禄劝居群直干形（QS）、云龙居群扭曲形云南松（YT）之间的遗传相似系数均高于0.95，说明云龙居群直干形云南松（YS）与其余测试分析云南松之间的亲缘关系较近。

表 3 云南松6个居群不同干形间遗传相似系数Table 3 Coefficient of genetic similarity among stem forms from 6 populations ofP. yunnanensis

进一步基于6个居群不同干形云南松遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，由图2可知，以0.93为阈值，可将6个居群不同干形云南松聚分为2个大组，第1大组由剑川居群、禄劝居群及云龙居群的扭曲形和直干形云南松组成，第2大组由鹤庆居群、永仁居群及丽江居群的扭曲形和直干形云南松构成。利用AMOVA软件对6个居群不同干形云南松进行主成分分析（图3），其分析结果与UPGMA聚类分析结果一致，剑川居群、禄劝居群及云龙居群的扭曲形和直干形云南松紧密地分布在一起，说明亲缘关系较近，而鹤庆居群、永仁居群及丽江居群的扭曲形和直干形云南松较松散地处于另一组，表明遗传差异相对较大。

基于遗传相似系数的云南松6个居群UPGMA聚类分析结果显示，以相似系数0.96为阈值，云南松6个居群聚分为2个分支，第1分支由鹤庆居群、永仁居群和玉龙居群构成，第2分支包含了剑川居群、禄劝居群和云龙居群（图4）。聚类分析结果与云南松6个居群分布的地理距离不一致，表明地理距离不是影响云南松6个居群遗传分化的主要因素。

图 2 6个居群不同干形云南松聚类图Fig.2 Dendrogram among stem forms from 6 populations ofP. yunnanensis

图 3 6个居群不同干形云南松主成分分析Fig.3 Principal coordinates analysis for stem forms among 6 populations ofP. yunnanensis

图 4 6个居群云南松聚类图Fig.4 Dendrogram of 6 populations ofP. yunnanensis

2.5 不同干形特有差异片段同源性分析

在14对SRAP引物扩增产物中，筛选出30条扭曲形和直干形云南松特有差异条带进行割胶回收，其中扭曲形云南松特有条带23条，直干形云南松特有差异条带7条。以特有差异条带溶解液为模板进行PCR扩增后，将PCR产物与pMD−18−T进行连接、转化，挑选白斑PCR扩增测序，成功获得26条带DNA序列，其中扭曲形云南松21条，直干形云南松5条。目的片段序列长度在152～426 bp之间，将26个特异片段序列在NCBI网站进行核酸BLAST对比，均对比到同源序列，相似度范围在79%～100%。扭曲形云南松特有条带5−T1、9−T1、10−T1与火炬松UMN_2204_01未知基因同源，相似度在82%～83%；4−T1、7−T1、8−T1、8−T2、9−T2、10−T2、14−T1

和14−T2共8条扭曲形云南松特有条带及直干形云南松特有条带9−S2的序列与火炬松7个功能基因同源，相似度在79%～90%；扭曲形云南松特有条带1−T1、1−T2、1−T3、6−T1、11−T3、11−T4、12−T1和14−T3及直干形云南松特有条带6−S1、14−S2与细菌rRNA 16S高度同源，相似度达99%～100%；扭曲形云南松特有条带11−T2、12−T2和直干形云南松特有条带1−S3、3−S1序列与水气单胞菌属DfrA17基因同源，相似度100%（表4）。

表 4 不同干形云南松特有差异条带序列的核酸BLAST同源性对比Table 4 Nucleic acid homology comparison of unique different band sequences among different stem forms ofP. yunnanensis

续表 4

将比对到同源基因的26条序列在Uniprot网站（https://www.uniprot.org）进行蛋白质同源性对比，8条序列未发现相似蛋白，另18条序列对比到10种相似蛋白（表5），其中1个为未知蛋白，9个分别为二氢硫辛酰胺酰基转移酶、过氧化氢酶、DNA导向的DNA聚合酶、WD重复蛋白、内切核酸酶或糖基水解酶、谷胱甘肽S转移酶1、铁硫载体集群蛋白、BnaC06g14100D蛋白和A20及AN1锌指蛋白。在10种相似蛋白中，扭曲形云南松特有条带序列特异地比对到7种。

表 5 不同干形云南松特有差异条带的蛋白BLAST同源性对比Table 5 Protein homology comparison of unique different band sequences among different stem forms ofP. yunnanensis

通过在Uniprot网站（https://www.uniprot.org）进一步查询相似蛋白的功能（表6），未知蛋白被亚细胞定位到线粒体，功能不详。其余蛋白均有其特定功能，其中有5种预测蛋白为酶类，在生物体内的多种代谢过程中充当催化剂，促进反应的发生[9-11]。A20及AN1锌指蛋白（SAP6基因），在动物免疫和植物胁迫反应中发挥着关键作用，能通过影响一些相同内源基因的表达，由一条共同的信号途径来增强植株对水分缺乏和盐胁迫的耐受性，此外，还在调节细胞伸长、赤霉素应答方面发挥着作用[12-15]。WD重复蛋白能正向调节TOR（雷帕霉素靶蛋白）信号[16-17]，而TOR是一种古老基因，几乎存在所有动植物细胞中，在调节细胞存活和凋亡过程中起关键性作用[18]。

表 6 相似蛋白质的功能Table 6 Functions of homological proteins

3 结论与讨论

云南松作为云南省山地造林的先锋树种，在云南省经济建设、社会发展、水土资源保护和环境地改善等方面起到了举足轻重的作用，具有其他树种不能比拟的适应力和生存力[2]。然而，由于人为伐优留劣等活动的干扰，加之环境条件恶劣，导致云南松林分严重衰退，地盘松和干形扭曲且生长矮小的“小老头”个体越来越多，直接影响到树干出材率，木材加工利用及木制品质量，个别林分甚至形成扭曲形云南松纯林，几乎全部不能作为经济用材，严重制约了云南省生态效益、经济效益和社会效益的发挥[1,19-20]。

林木干形的生长发育与其分布区生态环境条件关系密切，干形的多样性不仅反应了林木对生态环境的适应性，同时也是林木进化过程中的必然产物[21]。McKinney和Sando[22]报道了在短日照低光强控制下小麦叶轴的扭曲，由此提出光照差异对林木干形扭转的影响。在瑞士和巴伐利亚海拔100～1 200 m地区生长的欧洲山毛榉（Fagus sylvatica），干形几乎没有扭曲现象发生[23]，而对斐济主要人工林地区的加勒比松（P.caribaea）木材特性调查发现，海拔高地区比低洼地区扭转程度更小[24]。但也有一些案例表明，高海拔地区趋向于形成更极端的树干扭转林木，认为林木干形扭转的树体更能适应恶劣的环境，因此在生存、繁殖及更新上更具有优势[25-26]。陈守常和吕以强[27]对云南松干形扭转现象进行考察并对树干扭转的成因进行了分析，认为云南松树干扭转是该树种所具有的一种特性，林分条件（疏密度、年龄、土壤、水分），尤其疏密度则是决定树干扭转发生和发展的基本因素，而风在一定情况下是促进和强化树干扭转的外在因子。姜汉侨[28]结合云南松分布特点和地史变迁分析认为，树干扭曲是云南松固有性状，即具有可遗传性，并认为云南松树干扭曲度变化是连续的，是一种数量性状。何富强[29]以云南松优树种子、优树所在林分普通混合种子、商业调拨种

子和干形扭曲树体种子作育苗栽培试验，经过11年的观察和分析研究，认为云南松干形受遗传控制，树干的扭纹和直纹是一对相对性状，由一对等位基因所控制。此外，云南松是雌雄同株风媒传粉的异花授粉植物，种子具翅，可以靠风进行大范围的传播扩散，当直干形和扭曲形云南松种子通过风的传播落入同一片林分时，就极有可能出现直干形和扭曲形植株共存的现象[30-31]。但至今对调控云南松干形变异的功能基因知之甚少。

分子标记是研究种质资源遗传完整性的一种科学高效的实用技术，具有检测位点多、结果真实可靠、不受环境影响等优点[32]。在众多分子标记中，SRAP标记的上、下游引物分别对基因外显子和内含子及启动子区域特异性锚定，从而实现对功能基因开放阅读框ORFs（Open reading frames）的扩增，由于内含子、启动子与间隔长度存在差异，使SRAP标记产生多态性[33]。由此可见，SRAP标记的多态性条带反映了不同样本间在相关功能基因结构上的差异。本研究采用SRAP标记对云南松6个居群180份样本的遗传变异进行了分析，揭示出云南松具有较高的遗传多样性水平，而遗传变异主要来源于不同个体，居群间的遗传差异较小。该研究结果与采用SSR标记[34]、AFLP标记[35]及SNP标记[36]对云南松遗传多样性与遗传结构研究结果一致。由于云南松遗传变异不存在明显的地理隔离现象，而气候、地理和环境因素的影响更为显著[37-38]，从而使得云南松不同群体的聚类关系与地理分布不一致。

现有云南松林分中存在着广泛而丰富的干形扭曲变异现象，但其成因尚存在争议。周安佩等[35]采用AFLP标记对直干形和扭曲形云南松的遗传变异进行了分析，结果表明，不同干形云南松的遗传多样性水平与干形无明显的相关性。邓丽丽等[39-40]基于针叶性状和SSR标记对云南松不同茎干类型遗传变异分析也得到了相同的结论，云南松干形通直类型群体和干形扭曲类型群体间的遗传多样性存在差异，但多样性差异不大。本研究采用SRAP标记对直干形和扭曲形云南松的遗传差异分析结果显示，2种干形类型间遗传分化系数（Gst）仅为0.008 7，基因流（Nm）高达56.700 2，表明扭曲形和直干形云南松之间的基因交流频繁，没有发生明显的遗传分化，与上述研究结果一致。

与其他分子标记相比较，SRAP标记的最大特点是PCR扩增区域为功能基因开放阅读框（ORFs），扩增得到的多态性条带，直接体现了ORFs的多态性，进而体现出物种性状的差异[41]。本研究对直干形和扭曲型云南松中出现的特异多态性条带进行了回收、测序及序列比对，共比对到10个相似基因和10种相似蛋白，其中有7种相似蛋白特异性地与扭曲形云南松的SRAP多态性条带序列同源。而这些相似蛋白是否参与调控云南松干形扭曲性状的形成，还有待于进一步开展验证。育 种 策 略 剖 析 [J].西 部 林 业 科 学,2010,39(2):104−110.