李海霞,李映霞,程 芸,谷有全,雒 扬
(兰州大学第一医院神经内科,甘肃兰州 730030)
帕金森病(Parkinson disease,PD)是由中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性、丢失引起的神经退行性疾病。PD 患者主要表现为以静止性震颤、运动减少、肌强直、姿势步态异常等为主的运动症状,还多伴有以认知障碍、睡眠障碍、感觉障碍等为主的非运动症状[1]。PD 的发病率与年龄呈正相关。一项荟萃分析显示,从1983 年到2009 年,我国60 岁以上人口PD 平均患病率约为2.91%[2]。随着全球老龄化的进展,PD 势必会在不久的将来给全球尤其我国的卫生事业带来更多严峻的挑战。PD 的病因主要涉及遗传易感性、环境、衰老等因素,其发病机制的研究在α-突触核蛋白(α-synuclein,α-SYN)异常聚集、神经炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍等方面取得了一定进展[3]。但迄今为止,其确切病因及发病机制尚未被完全阐明,为精准诊断和规范治疗带来困难,目前的临床治疗只能改善症状,不能逆转疾病进展。可见,PD 的病因及发病机制研究是寻找治愈靶点的必由之路。
1994 年,Mogi 等[4]在PD 患者黑质纹状体区域发现大量炎症因子,PD 神经炎症与DA 神经元死亡之间的相关性随之被越来越多的研究所证实。随着对PD 炎症发病机制研究的深入,在PD 动物模型的中脑黑质中发现了Toll 样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)的异常激活[5],促进了PD 病因学与分子病理机制的研究。本文拟从TLR4 在PD 中的表达特征及TLR4 通路调控机制出发,结合我们的前期研究成果[6],综合国内外现有文献,对TLR4 在PD 发病机制中的作用进行系统梳理和综述。
TLR4 是一种模式识别受体,属于I 型跨膜糖蛋白,主要表达于巨噬细胞、树突状细胞等固有免疫细胞,在大脑中主要存在于小胶质细胞、星形胶质细胞等参与中枢神经系统免疫反应的细胞。TLR4 通过识别革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、呼吸道合胞病毒的F 蛋白、锥虫的甘油肌醇磷脂等病原相关分子模式(pathogene-associated molec⁃ular patterns,PAMP)和高迁移率族蛋白B1(high mo⁃bility group protein B1,HMGB1)、热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)等损伤相关分子模式(damageassociated molecular patterns,DAMP)而被活化[7]。TLR4 的主要结构和功能如下:(1)富含亮氨酸的胞外结构域:识别PAMP 和DAMP,形成受体复合物;(2)胞内Toll/白细胞介素1 受体[Toll/interleukin-1(IL-1)receptor,TIR]结构域:与IL-1 受体同源,负责募集下游衔接因子,触发信号从胞内向胞核转导。TLR4 活化后先发生寡聚化,后募集激活髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、诱导干扰素β 的含TIR 结构域衔接蛋白(TIR domain-con⁃taining adaptor protein inducing interferon-β,TRIF)、TRIF 相关衔接分子(TRIF related adaptor molecule,TRAM)等下游衔接因子,衔接蛋白被激活后发生一系列级联生化反应,启动下游信号传导,最终使信号由胞外传向胞核内,激活核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)、信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and ac⁃tivator of transcription 3,STAT3)等转录因子,不同转录因子启动相应靶基因转录和蛋白表达,如诱导肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β、IL-6 等促炎细胞因子产生并释放,发挥抗感染、自身免疫等效应。TLR4 被激活后,一方面启动固有免疫应答,相当于固有免疫的“电闸”;另一方面也可以通过释放趋化因子、调节T 细胞分化而调控适应性免疫应答[8],因此也被称为连接固有免疫和适应性免疫的“桥梁”。
动物实验发现,对小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra⁃hydropyridine,MPTP)建立PD模型后,相比野生型小鼠,TLR4基因缺陷小鼠的黑质-纹状体部位表现出更少的小胶质细胞激活和更少的DA 神经元丢失[9]。细胞实验也证实,在1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的BV-2 细胞中TLR4 表达上调[10]。对PD 患者尸检时发现中脑黑质中TLR4 的表达增加[11-12]。以上研究强烈提示,TLR4在PD发病与进展中扮演着重要的角色。
2.1 PD 中TLR4 的信号转导通路 TLR4 信号通路较复杂,涉及多种分子及衔接因子的参与。研究发现,慢性胃肠疾病[13]和恶性肿瘤[14]等多种疾病的病理机制都与TLR4 的异常激活有关,且均提示TLR4信号通路转导方式复杂而精细。PD 也不例外,其发病机制研究中,TLR4 信号转导涉及多条通路,其中首当其冲的是参与免疫炎症反应的经典TLR4/NFκB 通路[15-16]。有研究发现,TLR4 缺乏显著减弱了MPTP 诱导的PD 小鼠中脑部位TLR4/NF-κB 通路的激活,减轻了神经炎症[17-18]。
除此之外,在PD 病理过程中,TLR4 还可与调节细胞生长分化的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-acti⁃vated protein kinases,MAPKs)、调控细胞分化增殖的糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)、调控氧化应激的AP-1 和核因子E2 相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)等因子形成级联通路。对百草枯激活的BV2细胞的研究显示,相比MAPKs 抑制剂,TLR4 抑制剂更能显著逆转MAPKs的磷酸化,降低促炎细胞因子的转录水平[19]。对PD 动物模型的研究也发现,TLR4/TNF 受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)介导的MAPKs 信号通路的激活参与神经炎症过程[15]。同样,LPS 诱导的细胞炎症模型中,TLR4/MAPKs 信号通路也被发现参与激活小胶质细胞,最终引起SHSY5Y 细胞诱导分化的神经元炎性损害[16]。另外,Shao 等[20]在对α-SYN 刺激的神经炎症的研究中,发现TNF-α 表达受TLR4/磷脂酰肌醇3-激酶(phospha⁃tidylinositol 3-kinase,PI3K)/AKT/GSK3β 信号通路的调控。还有研究显示,MPTP 诱导的Tlr4-/-小鼠表现为AP-1 的表达下调[18];LPS 诱导的星形胶质细胞模型中,TLR4 激活引起Nrf2 表达下调[21]。此方面研究的局限性是,目前尚无研究证明以上各单独通路之间可能存在的串联、并联或级联等错综复杂的关系,还迫切需要思路清晰的大样本实验和人体试验以更好地阐明TLR4 在PD 中的信号转导通路和作用机制。
2.2 TLR4 与α-SYN α-SYN 作为路易小体的来源和PD 病理标志之一,一般认为α-SYN 的产生和降解失衡是造成其病理性累积的原因。近年来,α-SYN和TLR4 的关系有较多争议。Stefanova 等[22]发现,TLR4 的功能阻断或基因敲除都可导致小胶质细胞对α-SYN 的吞噬减少,造成小鼠大脑中α-SYN 的积累和DA 神经元的减少。另外一项类似研究[23]也证实,Tlr4-/-小鼠中脑部位α-SYN 蛋白聚集增多,大脑皮层、纹状体、海马和小脑中α-SYN 的mRNA 表达水平增高。基于α-SYN 聚集首先出现在嗅球和迷走神经中[24],Chen等[25]进行了对嗅球病理组织的研究,发现PD 模型小鼠嗅球中TLR4/NF-κB通路激活,p65蛋白的磷酸化水平显著升高。综合以上研究,小胶质细胞可能通过TLR4 依赖的方式调控α-SYN 在脑中的合成、清除和分布,TLR4 通路紊乱或转导失调可引起α-SYN聚集而导致PD的发生。
研究发现,α-SYN 可作为TLR4 激活剂诱导TLR4 信号通路激活,引起TNF-α 高表达为主的神经炎症[20]。Tlr4-/-巨噬细胞接受α-SYN 寡聚物刺激时,促炎因子分泌显著降低[12]。增加生理浓度的α-SYN低聚物剂量会敏化小胶质细胞和星形胶质细胞表面的TLR4,使得其下游促炎性细胞因子的产生增加[12]。另外,对星形胶质细胞的离体研究发现,重组人α-SYN 和寡聚体可以激活离体原代星形胶质细胞中TLR4 信号通路,导致促炎因子产生,但是星形胶质细胞对α-SYN 的摄取与TLR4 无关[12,26]。还有研究证实,α-SYN 通过激活TLR4 信号通路诱导C-X-C模序趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12;一种经典的炎症趋化因子)的分泌,而CXCL12 又参与了α-SYN 诱导的小胶质细胞积聚过程[27]。可见,α-SYN 似乎通过这种“自杀式”方式激活TLR4,从而介导其对自身的清除。当然,依赖α-SYN 的TLR4 激活的炎症病理过程可能也是PD 的早期病因。
2.3 TLR4 与氧化应激 氧化应激以活性氧簇(re⁃active oxygen species,ROS)产生过多为标志,涉及多种疾病的病理过程。很多学者认为,氧化应激可能是DA神经元死亡的关键环节。Zhao等[28]发现,氧化还原敏感性转录因子AP-1在PD模型小鼠中脑的DA神经元和星形胶质细胞中呈高表达,这一过程可能受到TLR4 信号通路的介导。该研究证实,Tlr4缺陷可减弱AP-1 的表达和DA 神经元的减少,减轻PD 小鼠的行为学障碍。前述Tlr4-/-小鼠在MPTP建模后也表现出中脑纹状体部位AP-1 表达的下调和ROS 的减少[17-18],进一步支持这个观点。
关于TLR4 信号通路在PD 氧化应激机制中发挥作用的详细机制,目前研究较少。对脑组织细胞色素P450 2J(cytochrome P450 2J,CYP2J)蛋白在PD中保护作用的研究表明,TLR4 被LPS 刺激后,通过下调CYP2J 而导致星形胶质细胞中抗氧化系统相关因子(Nrf2、SOD1、CAT 和GPx1)下调[21]。抗氧化相关的研究也发现,原苏木素A 可通过抑制小胶质细胞膜上CD14 和TLR4 的结合,减弱LPS 介导的IKKIκB-NF-κB 依赖性的氧化应激和硝化应激对神经元的损伤[29]。综上所述,TLR4 的激活主要通过参与氧化损伤过程或抑制抗氧化体系的运转而加速PD 病变进展,提示抗氧化因子可能以TLR4为靶点对治疗PD有益。
2.4 TLR4 与神经炎症 TLR4 是固有免疫反应的关键触发点,这使得聚焦于TLR4 的PD 相关研究也大多以检测促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2等)为切入点,以神经免疫炎症反应研究为重点[30-32]。TLR4在PD 神经炎症反应的启动、级联放大、神经损伤等过程中都发挥着重要作用[33-35]。我们的前期研究也证实,特异性抗TLR4抗体可以部分阻断PD 模型小鼠中脑的神经炎症过程,降低小胶质细胞的活化,减少促炎因子TNF-α 和IL-β 的表达,从而部分缓解小鼠的行为学异常[6]。需要强调的是,前述神经元衍生的IgG 通过激活TLR4通路促进TNF-α的表达,最终表现为减轻6-羟基多巴胺(6-hydroxydo⁃pamine,6-OHDA)引起的DA 神经元损伤[36]。TLR4信号通路被α-SYN 激活后分泌炎症因子,进而启动对α-SYN 的清除[22],也表现为对PD 脑组织的神经保护作用。此外,对TLR4 与氧化应激相关性的研究中,参与炎症反应的NF-κB p65 和参与氧化应激的AP-1 同时上调[18]。对TLR4 与“脑肠轴”相关性的研究中也发现了促炎因子的产生[37]。可见,TLR4 在PD 非炎性机制中的作用也可能以其启动炎症反应为基础,或者说二者互相穿插、互为依赖。
2.5 TLR4 与“脑肠轴”近年来,随着肠道菌群与慢性炎症反应性疾病相关性研究的深入,PD 研究领域的“脑肠轴”发病假说随之确立。脑肠轴是脑和肠之间的信息交流系统,由免疫、迷走神经和神经内分泌途径构成。早有研究报道,MPTP 建模的PD 小鼠十二指肠和远端结肠的TLR4 蛋白表达均显著增加[38]。后有研究进一步证实,PD 模型小鼠表现为明显的肠道微生物生态失调,向PD 小鼠肠道移植正常小鼠的肠道菌群,可通过抑制TLR4信号通路减轻肠道炎症和神经炎症,减轻运动损伤[39]。另外一项研究发现,PD 患者的结肠肠壁屏障存在破坏,结肠黏膜中TLR4 和CD3 阳性T 细胞的表达增高,结肠中的促炎因子表达量增加,与健康对照相比,粪便微生物群的组成的也呈现出明显差异[37]。该研究组还利用PD 小鼠进行了深入研究,发现相比野生型小鼠,Tlr4-/-小鼠在鱼藤酮建模后表现为更少的肠道炎症、更小的肠屏障功能破坏、更轻的肠道运动功能障碍、更少的结肠肌间神经丛肠神经胶质细胞激活、更少的α-SYN 水平增加和更少的黑质DA 神经元丢失。以上研究进一步说明,PD 发病过程中,TLR4 介导的病理紊乱不仅仅局限于脑部。由此可见,TLR4 似乎是肠道菌群失调、肠道炎症和神经炎症之间的媒介或连接点,可以作为PD 寻找全身免疫性病因的突破口。
McCabe 等[40]使用不同PD 建模药物进行动物实验,向大鼠纹状体内注射6-OHDA 后第28 天、LPS 后第4 天和聚肌胞苷酸[polyinosinic:polycytidylic acid,poly(I:C)]后第14 天,纹状体内均出现显著的TLR4高表达,由此可以推测,TLR4 在神经毒性、炎症和环境相关致病因素对PD 的影响中均发挥作用。另一项研究发现,Tlr4敲除显著减轻了PD 模型小鼠的运动障碍、α-SYN 沉积和DA 神经元的丢失,减轻了中脑纹状体部位ROS 堆积为主的氧化应激,减弱了小胶质细胞和星形胶质细胞激活为主的神经炎症[17]。这些研究进一步说明,TLR4 并非通过参与某种单一病理机制影响PD 发病,而是从多方面综合地发挥作用。
现阶段,以PD 为背景的TLR4 研究主要集中在基于调节TLR4 的PD 治疗药物对PD 治疗新靶点的探索。在调控TLR4 信号通路的因子及治疗药物研究中,以负调节为主要导向。
3.1 PD 中调节TLR4 通路的内源性因子 随着人们对PD 发病分子机制研究的进展,涌现出许多新的调控TLR4传导通路的内源性生物分子。研究发现,PD 患者死后被尸检时,黑质中凝血酶原kringle-2(prothrombin kringle-2,pKr-2)升高,pKr-2 可激活小胶质细胞上的TLR4,诱导神经损伤[41]。与之相反,许多内源性因子通过参与调控TLR4通路转导,表现为对PD 神经组织的保护作用。对PD 致病相关基因DJ-1的研究发现,在LPS 诱导的星形胶质细胞中,DJ-1 蛋白通过调节脂筏(lipid raft)依赖的内吞作用,增强质膜对TLR4和CD14的内吞,从而对LPS-TLR4-TNF-α 信号通路产生负性调节作用,抑制炎症反应[42]。类似的还有,髓样细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)存在于小胶质细胞上,其过表达能显着降低PD 小鼠中脑TLR4 信号通路的激活,减轻神经炎症和DA 神经元损伤[15];C2 神经酰胺可通过抑制LPS 与小胶质细胞表面的结合而减弱TLR4信号通路的转导[43];生理剂量的神经元源性IgG 可以活化小胶质细胞上TLR4/MyD88通路,促进TNF-α的表达,减少6-OHDA对DA神经元的损伤[36];二氢睾丸素(dihydrotestosterone,DHT)也通过抑制TLR4/NF-κB 和MAPK 信号转导,减少小胶质细胞中炎性介质的释放,发挥神经保护作用[16]。这些因子的发现在PD 防治中具有重要价值,可作为以TLR4 为靶点的衍生靶点逆转或阻止PD病变进展。
3.2 PD 中调节TLR4 通路的外源性因子 除了上述内源性因子,部分外源性化学药物成分也表现出通过负调节TLR4 通路的转导而治疗PD 的潜能。研究发现,2-环丙基亚氨基-3-甲基-1,3-噻唑啉盐酸盐(2-cyclopropylimino-3-methyl-1,3-thiazoline hydro⁃chloride,KHG26377)可有效逆转LPS 激活的BV-2细胞中TLR4/NF-κB 信号通路的活化,从而抑制促炎介质的产生和释放[44]。与此类似,N-金刚烷基-4-甲基噻唑-2-胺(N-adamantyl-4-methylthiazol-2-amine,KHG26693)可通过阻碍CD14与TLR4间的相互作用而减弱TLR4的激活,发挥抗炎作用[45]。还有研究发现,新型脂介体resolvin D2(RvD2)可剂量依赖性地减轻PD 大鼠中脑小胶质细胞的活化和DA 神经元的炎性损伤,该功能与RvD2 对TLR4/MyD88/NF-κB p65 信号通路的抑制作用相关[35]。酪氨酸激酶小分子抑制剂PD180970 可诱导神经元自噬,抑制TLR4介导的促炎细胞因子上调,减轻神经炎症,对N27-BV2 细胞炎症模型和MPTP 小鼠模型发挥神经保护作用[46]。
除此之外,一些临床用药也为PD 的临床治疗研究提供了更多的选择和更广阔的思路。研究显示,小胶质细胞在与Aβ42、LPS、α-SYN 和PrP82-146 共孵育活化的过程中,降糖药格列美脲通过激活GPIPLC 诱导CD14 从细胞脱落,从而抑制TLR4 通路的活化,导致TNF-α、IL-1、IL-6 等炎症细胞因子的分泌减少,发挥新的抗炎作用[47]。在维生素D对MPTP诱导的PD小鼠神经保护作用的研究中,以及乙酰基-L-肉碱对单侧纹状体6-OHDA 诱导的PD 小鼠神经保护作用的研究中,均发现了TLR4 的表达下调[48-49]。鉴于2 型糖尿病会增加PD 的风险,Fang 等[31]研究了胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)对PD 的影响,发现饲喂MG1363-pMG36e-GLP-1 菌株可以显着降低TLR4 的表达,减少促炎因子的生成;出乎意料的是,还可使PD 模型小鼠的微生物多样性恢复到正常水平,减少病原菌并增强益生菌数量。该研究使得已批准上市、临床用药成熟、毒副作用较明确、剂量可控的GLP-1 受体激动剂exenatide应用于PD 治疗成为可能,有望进行人体试验和实现近期临床应用。
调节TLR4 通路的外源性药物成分中,很多具有抗炎、抗氧化活性的中草药提取物也被证实可通过抑制TLR4激活而有益于治疗PD。LPS诱导的PD 小鼠模型中,何首乌提取物胡桃苷可通过减弱海马TLR4/NF-κB 信号通路转导,降低促炎细胞因子,从而改善小鼠的记忆[32]。MPP+诱导的BV-2 细胞模型中,杜鹃素可通过抑制的TLR4/NF-κB 信号通路减弱炎症反应[30]。五味子素可通过抑制TLR4 的激活而减弱LPS 诱导的小胶质细胞神经炎症反应[33]。另外,山药提取物薯蓣皂素[50]和淫羊藿提取物淫羊藿次苷II[51]均可通过抑制TLR4信号通路在LPS诱导的大鼠PD 模型中发挥DA 神经元保护作用。在对黄芩甙元对鱼藤酮诱导的PD 大鼠模型的抗神经炎症作用的研究中,也发现了TLR4 的下调[52]。同样,有研究发现,迷迭香酸可抑制HMGB1/TLR4/Myd88/NFκB 信号通路激活,最终减少中脑小胶质细胞活化和炎症介质的产生,增加DA 细胞的数量,剂量依赖性地改善PD 小鼠的运动功能[34]。另外,山柰酚通过抑制HMGB1/TLR4 通路的激活,抑制促炎细胞因子的产生,恢复纹状体组织中血脑屏障的完整性,发挥DA神经元保护作用[53]。
上述中药活性成分均通过负调节TLR4 发挥抗炎作用。除此之外,还有研究发现,蓝萼乙素(山苏子提取物)通过抑制TLR4/NF-κB 和激活Nrf2/HO-1途径减轻LPS 诱导的炎症和氧化应激,缓解PD 大鼠的运动障碍和感觉障碍[54]。Haddadi 等[55]探讨了水飞蓟素(从植物水飞蓟的种子中提取的类黄酮)对6-OHDA 建模的PD 大鼠模型黑质致密部氧化应激、凋亡和TLR4表达的影响,证实水飞蓟素预处理可能通过抑制黑质TLR4 过表达来减少PD 大鼠中脑黑质部的神经元凋亡。
4.1Tlr4的遗传多态性与PD 的发病风险 Zhao等[56]分析了Tlr4的遗传多态性与中国汉族人群PD发病风险的相关性,发现Tlr4的rs1927914 多态性可能会减少散发性PD 和男性PD,且rs1927914 的C 等位基因可能是PD 患者的保护因子,进一步确定了TLR4与PD的关系。另外一项对基因-环境相互作用的研究分析了Tlr4单核苷酸多态性和饮酒相互作用对PD 风险的影响,发现rs7873784-G 等位基因和rs19279149-C 等位基因携带者的PD 风险显着升高,且rs7873784-G、rs19279149-C 等位基因和rs1927914与饮酒之间的相互作用与PD 风险降低相关[57]。这种以PD 患者为受试对象、利用遗传学工具进行的基因水平研究相对更加客观、严谨,是对基础实验局限性的完善和补充,为PD 的诊断研究提供了更广阔的思路。
4.2 外周血TLR4 与PD 的相关性 除在胶质细胞表达外,TLR4 主要存在于外周血单个核细胞膜上。有研究报道,相比健康对照者,PD 患者尾状核和壳核中TLR4 表达增加,外周血单个核细胞和B 细胞中TLR4 的表达也增加[11]。对PD 患者外周血先天性免疫相关标志物的检查发现,PD 患者外周血TLR4 阳性单核细胞的百分比较健康对照升高,且与早期痴呆的风险明显相关[58]。同样,Yang等[59]也发现PD患者外周血中HMGB1 和TLR4 蛋白含量较正常人增高,且HMGB1和TLR4蛋白含量与药物治疗疗效、临床分期和病程长短密切相关,即药物治疗疗效差的PD 患者外周血HMGB1 和TLR4 的含量较疗效好者高,在较高PD 分期的患者中发现较高的HMGB1 和TLR4 水平,病程长的患者外周血HMGB1 和TLR4 含量明显高于病程短者。此外,不同年龄PD 患者的外周血白细胞接受TLR4 激动剂刺激时,TNF-α 的产生与PD 发病年龄和疾病持续时间呈负相关[60],提示TLR4 的敏感性可能也会随年龄增长而下降。鉴于外周血标本获取安全、方便、快捷,随着TLR4 与PD关系的临床试验研究进展,外周血TLR4检测有望成为PD 一级预防、早期诊断、精准治疗、临床分期和预后评估的新型标志物和依据。
综上所述,TLR4 通过对神经炎症、α-SYN 聚集、氧化应激、“脑肠轴”等病理生理过程的精密而复杂地调控,从多方面综合影响PD的发生发展(图1)。
Figure 1.Schematic diagram of the role of TLR4 signaling path⁃way in PD based on existing studies.图1 TLR4信号通路在PD中的作用示意图
此外,TLR4 是人体抵御病原微生物入侵的重要防线,PD 的治疗中不适当地阻断TLR4 势必会对人体固有免疫功能造成巨大危害,这使得如何找到既不损害固有免疫又能抑制TLR4 过表达之间的平衡点显得尤其重要。