肠道ChREBP缺陷导致小鼠对果糖不耐受*

张 晶，陆俊宇，闫学德，苏 凯，曹冬梅，章卫平

（海军军医大学基础医学院病理生理学教研室，上海 200433）

高果糖玉米糖浆由于成本低、甜度高等优点，作为甜味剂被广泛应用于食品工业。果糖虽与葡萄糖分子量完全相同，但二者在哺乳动物中的代谢路径有显著差异［1］。近年来，大量流行病学资料和实验研究表明，果糖摄入过量可能是肥胖、高血脂、高血压、胰岛素抵抗和高尿酸血症的危险因素［2］，且与糖尿病、脂肪肝和痛风等代谢性疾病的发病率升高密切相关，因此，有关果糖代谢及其调节机制的研究是代谢领域的前沿热点。葡萄糖转运蛋白5（glucose transporter 5，GLUT5）是参与小肠吸收果糖的关键转运子，主要分布于小肠上皮细胞的刷状缘，其编码基因为Slc2a5［3-4］；而GLUT2 负责将葡萄糖和果糖转运到血液循环，主要分布于基底膜外侧，其编码基因为Slc2a2［5］。与葡萄糖不同，肠道对于果糖的吸收能力很容易达到饱和，成年人每天吸收果糖的饱和剂量约为5～50 g。

碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate re⁃sponse element binding protein，ChREBP）是调控果糖代谢的关键性转录因子，通常以与Max 样蛋白（Maxlike protein X，MLX）形成异源二聚体的形式发挥转录调节作用［6］，两者都是螺旋-环-螺旋（helix-loop-he⁃lix）转录因子家族的成员，含有碱性亮氨酸拉链结构［7］。由于所用启动子和第1 外显子的差异，ChREBP 蛋白有α 和β 两种不同的亚型［8］，正常细胞中存在的ChREBP 主要是α 亚型，但目前认为ChREBP 的主要活性形式是β 亚型，其主要分布于核内，蛋白水平非常低，但体外的转录活性是α 亚型20倍。ChREBP全身敲除小鼠对果糖不耐受，在高果糖饮食后出现体温降低，约半数小鼠在一周内死亡，表明ChREBP 是维持机体果糖耐受所必需的关键性转录因子。ChREBP在肝脏组织、脂肪组织、小肠组织、肌肉组织、肾脏组织及胰岛β 细胞中均存在高表达［9］，参与了糖酵解、脂质合成、果糖分解和糖异生等代谢通路中众多关键酶的转录调控［10］。然而，在ChREBP维持机体果糖耐受过程中，发挥关键作用的代谢器官和代谢环节是什么？ChREBP 如何感应果糖变化？其中涉及到哪些生化机制？这些科学问题亟待解决。以往认为，肝脏是哺乳动物果糖代谢的主要器官，新近研究发现摄入的低剂量果糖主要在小鼠小肠上皮细胞中转变为葡萄糖和有机酸等代谢产物，摄入的过量果糖经门静脉进入肝脏代谢，提示小肠在果糖代谢中发挥重要作用［11］。鉴于小肠在果糖代谢过程中的核心地位，本研究利用Cre/loxP 系统构建了ChREBP的肠道特异性基因敲除小鼠模型，研究肠道ChREBP 是否在果糖反应性激活小肠上皮细胞表达GLUT5和维持果糖耐受中发挥至关重要的调节作用。

材料和方法

1 动物

ChREBPflox/+小鼠由本实验室委托上海南方模式生物科技发展有限公司构建，为C57BL/6J 和129/Sv混合遗传背景，在ChREBP基因8号外显子两端分别插入loxP 位点［12］；Villin-Cre 工具鼠［B6.Cg-Tg（Vil-Cre）977Gum/J］引自Jackson 实验室，该工具鼠只在肠道上皮细胞中表达Cre 酶［13］。将ChREBPflox/+小鼠与Villin-Cre 工具鼠交配获得ChREBPflox/floxVillin-Cre小鼠，即ChREBP的肠道特异性基因敲除（ChREBP⁃gut-specific knockout，ChGO）小鼠。小鼠按照SPF 级动物饲养标准在本实验室饲养繁殖，环境温度25℃，湿度40%～70%，小鼠饲料、垫料和饮水均经过高温高压灭菌处理，光照周期为12 h光照/12 h黑暗。

2 主要试剂

鼠尾基因组DNA 裂解液［0.2% SDS、0.2 mol/L NaCl、0.005 mol/L EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和0.5 mol/L 蛋白酶K）；尿素裂解液［0.025 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1% SDS、8 mol/L 尿素、0.001 mol/L EDTA 和0.14 mol/L β-巯基乙醇］；Trizol 和DNA marker（TaKaRa）；琼脂糖（BioFROX）；PCR Mix（上海旭飞生物科技有限公司）；PCR引物（上海生工生物技术公司合成）；anti-ChREBP 抗体（SC-33764，Santa Cruz）；anti-β-Actin 抗体（66009-1，Protein⁃tech）；anti-GLUT5 抗体（SC-271055，Santa-Cruz）；65%高果糖饲料（D11707R，Research Diet）；逆转录试剂盒（TOYOBO）；SYBR Green Real-time PCR Mas⁃ter Mix（A25742，Thermo Fisher）；DMEM 培养基（HyClone）；Effectene 基因转染试剂盒（QIAGEN）；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）；其他常用试剂为国产分析纯。

3 主要方法

3.1 小鼠基因型的鉴定 取3 周龄小鼠尾巴，用蛋白酶K 消化法提取基因组DNA 进行PCR 鉴定。loxP的上、下游引物序列参照本实验室文献［12］，野生型的等位基因的扩增产物为593 bp，重组的等位基因的扩增产物为681 bp。PCR 反应条件为95℃1 min；95℃15 s、54℃15 s、72℃30 s，共30 个循环；72℃5 min。Cre 的上游引物序列为 5'-CCGGGT⁃GGGCAGGGTAGAGG-3'，下游引物序列为5'-GCA⁃GATGGCGCGGCAACAC-3'，扩增产物为912 bp。

3.2ChREBP基因敲除效果的Western blot分析 取8周龄ChGO小鼠和对照（wild type，WT）小鼠的空肠和肝脏，用尿素裂解液提取总蛋白后超声处理，加入相应量的上样缓冲液后，进行SDS-PAGE，而后转膜至PVDF 膜，用5%的脱脂牛奶在室温下封闭1 h。用抗ChREBP抗体或抗β-actin抗体孵育过夜（按照1∶1 000比例稀释抗体），TBST缓冲液洗3遍，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠多聚抗体（按照1∶5 000比例稀释抗体），室温下孵育1 h，TBST缓冲液洗3遍，加入ECL 试剂，放入化学发光分析系统（Fujifilm）扫描分析。

3.3 组织免疫荧光染色 取8 周龄的ChGO 小鼠和对照小鼠的空肠和肝脏，经4%的多聚甲醛固定过夜，PBS 洗15 min×3 次，在4℃的PBS 中浸泡过夜，然后依次在50%、65%、85%和95%的乙醇中浸泡1 h脱水处理后，在95%的乙醇中浸泡过夜，而后在无水乙醇中浸泡45 min×3次，常规石蜡包埋、切片。切片经脱蜡、梯度乙醇脱水后，进行抗原修复，然后用0.01 mol/L 的PBS 漂洗5 min×3 次，滴加10% BSA 在37℃湿盒内封闭30 min，然后吸尽封闭液，加入Ⅰ抗（抗ChREBP抗体和抗GLUT5抗体，1∶2 000），将玻片置于湿盒中，于4℃冰箱中孵育过夜。PBS 漂洗5 min×3 次，避光加入Ⅱ抗，37℃温箱中避光孵育90 min，PBS 漂洗2 次，避光滴加DAPI，室温下孵育20 min，PBS漂洗2次，甘油封片。荧光显微镜下观察，阴性对照用PBS 代替I 抗。胞核及胞浆中出现红色或蓝色荧光为阳性细胞，阴性对照细胞不出现荧光。

3.4 小鼠的果糖耐受性分析 取8 周龄ChGO 小鼠和对照小鼠，给予65%高果糖饲料饮食，每天监测其体重和摄食量。分别于高果糖饮食17 h 和2 周后处死小鼠，剖腹观察盲肠和结肠外观，取空肠用于蛋白和mRNA 水平的检测，另取空肠和肝脏进行免疫组化分析。

3.5 RT-qPCR 检测ChREBP、Slc2a5和Slc2a2的表达 取实验小鼠的空肠，用Trizol 抽提总RNA 后，进行DNA 酶处理和逆转录，得到cDNA。ChREBP的上游引物序列为5'-CGACACTCACCCACCTCTTC-3'，下游引物序列为5'-TTGTTCAGCCGGATCTTGTC-3'，退火温度为59℃；Slc2a5的上游引物序列为5'-GGAGCTGGCCCCGAAAAACCTACG-3'，下游引物序列为5'-CCGCCGCCTTCTCAGCCTCATC-3'，退火温度为63℃；Slc2a2的上游引物序列为5'-TTCCTT⁃GGGCCTTACGTGTTCTTC-3'，下游引物序列为5'-CCTGGTCGGTTCCTCGGTTTTAG-3'，退火温度为57℃。定量PCR 以36B4为内参照，上游引物序列为5'-TGGTTGCTTTGGCGGGATTAGTCG-3'，下游引物序列为5'-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCTGTG-3'，采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA的相对表达量。

3.6Slc2a5启动子的转录活性分析 在小鼠肠道中，Slc2a5基因的启动子区包含了该基因转录起始位点上游-1532/+1 个核苷酸区段，将这一段DNA 经XhoI/HindⅢ酶切，克隆进pGL4.11-Basic 载体，得到的质粒简称为Slc2a5-1.5Luc（本室质粒库编号#785）。基于pCMV-Tag 2B 载体构建的小鼠ChREBPβ 表达质粒（编号#486）和基于pCMV-Tag 2B 载体构建的小鼠Mlx-β表达质粒（编号#789）由本室构建、保存。将HEK293-A 细胞接种于24 孔板，每孔8×104个细胞，用含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基，置于5% CO2、饱和湿度的37℃培养箱内培养过夜。待细胞密度达到40%～70%时，用脂质体Effectene 进行基因转染，以RL-SV40 质粒为内参照。转染24 h 后裂解细胞，用双萤光素酶检测试剂盒（Promega）、Glo⁃Max 化学发光检测仪检测萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶活性，算出比值，用第1 组的平均值标化后计算出相对萤光素酶报告基因活性倍数。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。数据均符合正态分布，两组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 ChREBP基因肠道特异性敲除小鼠的构建

将ChREBPflox/+小鼠与Villin-Cre 小鼠进行交配，最终获得ChREBP基因肠道特异性敲除的ChGO 小鼠（图1）。

Figure 1.Schematic demonstration for the generation of ChREBP gene gut-specific knockout mouse model.NLS：nuclear localization signal；Pro-rich：proline-rich domain；b-HLH：basic helix-loop-helix；ZIP：Zipper.图1 ChREBP基因肠道特异性敲除小鼠模型的构建流程

2 ChREBP基因敲除效率和组织特异性的分析

为了进行快速批量的基因型分析，本研究利用针对第8 外显子下游的loxP 位点设计的基因型鉴定引物，结合Cre 的鉴定结果，可快速判断小鼠的基因型，基因型为flox/flox/Cre 的小鼠即为ChREBP基因成功敲除（图2A）。取ChGO 小鼠和对照小鼠的空肠和肝脏组织，分别提取蛋白和mRNA 进行Western blot 检测和RT-qPCR 检测，结果都表明ChGO 小鼠的空肠组织中没有检测到ChREBP 表达，而对照小鼠的空肠组织中检测到ChREBP 表达，说明在ChGO 小鼠空肠组织中已经成功敲除了ChREBP基因；在对照基因和ChGO 小鼠肝脏组织内ChREBP 的表达水平没有明显差别，说明肝脏中的ChREBP 水平不受影响（图2B、C）。免疫荧光染色分析显示，未饥饿状态下的对照小鼠空肠上皮细胞中ChREBP 表达丰富，主要位于胞核，而在ChGO 小鼠空肠上皮细胞中未检测到ChREBP 表达（图2D）；而ChREBP 在对照小鼠和ChGO小鼠肝细胞中的表达并没有明显差别，且主要位于细胞核，表明ChREBP 蛋白在ChGO 小鼠空肠上皮细胞中被特异性敲除，同时肝脏组织中ChREBP的表达及其核定位不受影响。

Figure 2.Analysis of ChREBP deletion efficiency and tissue specificity.A：representative demonstration for PCR-based genotyping with tail genomic DNA；B：Western blot analysis for ChREBP protein expression in the jejunum and liver；C：relative mRNA expression levels of ChREBP in the jejunum and liver；D：immunofluorescence staining for ChREBP（red）in the je⁃junum and liver of ChGO and WT mice（×10）.Mean±SD. n=18.ND：not detectable.图2 ChREBP基因敲除效率和组织特异性的分析

3 ChREBP基因肠道特异性敲除小鼠的表型分析

普食条件下，成年ChGO 小鼠与WT 小鼠的体重没有明显差异，但在65%高果糖饮食2 周后，ChGO小鼠相较于WT 小鼠，体重明显减轻（P＜0.01，图3A）。在65%高果糖饮食36 h 后，相较于WT 小鼠，ChGO 小鼠出现摄食量明显减少（P＜0.01，图3B）和体重明显减轻（P＜0.01，图3C）。普食条件下，ChGO和WT 小鼠大小肠外观均正常，但在高果糖饮食2 周后，ChGO 小鼠出现盲肠明显胀气膨大，而WT 小鼠大小肠外观正常（图3D）。研究期间对于ChGO 小鼠和WT 小鼠，取材达50 对，高果糖饮食后的每只ChGO 小鼠均会出现盲肠胀气的表现。这些都表明，肠道ChREBP被敲除后，机体对果糖严重不耐受。从小鼠空肠HE组织切片染色可以看出，无论是在普食状态还是高果糖饮食后，ChGO 小鼠与WT 小鼠的肠道内部形态没有明显差异（图3E）。

4 肠道ChREBP 基因敲除对果糖转运子基因表达的影响

Figure 3.Deletion of ChREBP gene in the gut results in fructose intolerance.A：body weight of female ChGO and WT mice fed with 65% high-fructose diet（HFR）for 2 weeks；B and C：food intake（B）and body weight gain（C）of female ChGO and WT mice fed with 65% high-fructose diet（HFR）for 36 h；D and E：representative images of small intestine，cecum and colon in situ（D）and HE-stained jejunal sections（E）of 50 pairs of ChGO and WT mice after 2 weeks of normal chow or HFR taken（×10）.The blue arrows point to the stomach，and the red arrows point to the cecum.Mean±SD. n=18.**P＜0.01 vs WT group.图3 ChREBP基因肠道特异性敲除导致果糖不耐受

普食条件下，ChGO 小鼠与对照小鼠肠道Slc2a5水平没有明显差别；但是在65%高果糖饮食17 h后，对照小鼠肠道Slc2a5水平相较普食时大幅上升，而ChGO 小鼠的肠道Slc2a5水平与普食时相比没有明显变化（图4A）。免疫荧光染色分析显示，普食条件下ChGO 小鼠与对照小鼠肠道GLUT5 蛋白水平都非常低，且没有明显差别；但是在高果糖饮食2 周后，对照小鼠肠道GLUT5 水平相较普食时显著上调，且主要分布于空肠上皮细胞刷状缘，而ChGO小鼠空肠GLUT5 水平与普食时相比没有明显变化（图4B），这说明高果糖饮食上调了对照小鼠肠道Slc2a5水平，提示其肠道对于果糖的吸收能力增强；但在ChGO小鼠体内，高果糖刺激几乎丧失对肠道Slc2a5的激活作用，提示肠道ChREBP 的表达在高果糖饮食对于肠道Slc2a5的转录激活效应中有决定性作用。无论是普食条件下还是高果糖饮食后，肠道ChREBP的敲除都会引起肠道表达Slc2a2下调（P＜0.05，P＜0.01，图4A）。另外，对照小鼠在高果糖饮食后肠道Slc2a2相较于普食时没有明显变化，但是Slc2a5却明显上调，说明小肠上皮细胞Slc2a5是受到果糖激活的主要转运子。

5 ChREBP调控Slc2a5基因转录活性

为了体外分析ChREBP 对Slc2a5基因转录活性的调控作用，我们克隆了小鼠Slc2a5基因启动子，发现其在HEK293A 细胞中有较强的基础转录活性；ChREBP-β和Mlx-β共转染能有效激活Slc2a5基因启动子，提示ChREBP 可直接激活Slc2a5基因的转录，见图5。

讨论

果糖摄入过量是代谢综合征的重要危险因素［14-15］。ChREBP 被认为是调控果糖代谢的重要转录激活因子，是维持机体果糖耐受所必需的关键环节，但其发挥这一作用的确切机制及组织定位尚不清楚。本实验室为了更好地研究ChREBP 在果糖代谢中的生物学功能，利用Cre/loxP 系统建立了ChREBP肝脏敲除小鼠模型。肝脏ChREBP敲除的小鼠出现肝脏糖原蓄积和ATP 稳态紊乱，可能是其肝脏毒性的重要原因［12］。但是单纯的肝脏毒性尚不足以解释ChREBP全身敲除导致的果糖不耐受，ChREBP 在肝脏、肠道、骨骼肌和脂肪组织中都有丰富表达，其维持机体果糖耐受这一作用的关键组织定位仍待进一步探究。

Figure 4. ChREBP deletion resulted in loss of transcriptional activation of Slc2a5 by fructose in intestinal.A：relative mRNA levels of fructose transporters in the intestine of ChGO and WT mice after 17 h of HFR or normal chow；B：immunofluorescence staining for GLUT5（red）in the jejunum of ChGO and WT mice after 2 weeks of HFR or normal chow（×20）.Mea±SD. n=18.**P＜0.01 vs WT chow group；#P＜0.05 vs WT fructose group.图4 ChREBP基因缺陷导致果糖丧失对肠道Slc2a5基因的转录激活作用

最新的13C 示踪实验发现，摄入的低剂量果糖主要在小鼠的小肠上皮细胞中转变为葡萄糖和有机酸等代谢产物，过多摄入的果糖经门静脉至肝脏代谢，提示小肠在果糖代谢中发挥重要作用［11］。因此本研究基于实验室前期构建的ChREBP的条件敲除小鼠模型，利用Cre/loxP 系统［16］构建了ChREBP的肠道敲除小鼠模型，并在基因组、mRNA 和蛋白水平验证了该模型的基因敲除效率和组织特异性。ChGO 小鼠在高果糖饮食后出现明显肠胀气、摄食量减少和体重明显减轻等果糖严重不耐受表现，推测是由于肠胀气严重，ChGO 小鼠摄食量下降，继而体重减轻。进一步分析肠道果糖转运子的表达，肠道ChREBP敲除后高果糖饮食丧失对于肠上皮Slc2a5的转录激活作用。这些结果都说明肠道ChREBP 对于机体维持果糖耐受有至关重要的作用。最近的研究报道也显示，机体果糖耐受所必须的是肠道ChREBP，而非肝脏ChREBP［17］。我们通过报告基因检测，发现ChREBP-β/Mlx-β 能显著促进Slc2a5基因的转录，这一结果提示Slc2a5可能是受ChREBP 转录调控的靶基因，而ChREBP调控Slc2a5可能是机体维持果糖耐受中的关键环节。另外，早期研究表明GLUT5全身敲除小鼠在高果糖饮食后，会有严重肠胀气，体重明显减轻［3］，其与ChGO 小鼠表型的相似性也提示Slc2a5是ChREBP 的靶基因。后续还需继续检测果糖代谢通路上的其他关键分子的表达，分析果糖代谢各环节的变化，并通过分子生物学和细胞学实验证实ChREBP 对于Slc2a5的激活作用。果糖在人体中的能量代谢机理和病理作用正受到广泛关注，研究ChREBP 维持果糖耐受的确切机制对于缓解果糖过度摄入造成的代谢综合征有重要价值。本研究构建的ChREBP肠道特异性敲除小鼠模型为探索肠道ChREBP 在果糖代谢中的具体作用机制提供了新思路和可靠基础。

Figure 5.ChREBP-β promoted the Slc2a5 gene transcription significantly.Relative luciferase activity of HEK293-A cells after 24 h of transfection of different plasmid was showed.Mea±SD. n=18.**P＜0.01 vs control group.图5 ChREBP-β/Mlx-β显著促进Slc2a5基因的转录