利多卡因对脓毒症大鼠心肌损伤及Nrf2/HO-1通路的影响*

程 梅，董晓筠，朱 彬

（杭州市妇产科医院麻醉科，浙江杭州 310000）

脓毒症可引起肾、肺、心和肝等多种组织器官损伤及严重并发症，死亡率较高［1-3］。脓毒症早期即可出现心肌损伤，发生率高达50%，而心源性脓毒症休克患者病死率可高达70%［4］，目前脓毒症心肌损伤主要有抗感染、体液复苏及使用儿茶酚胺强心类药物治疗等方法，但这些对心源性休克患者长期预后效果不佳，尚需寻找新的治疗方案［5-6］。利多卡因是一种临床常用的局部麻醉药及抗心律失常药，近来研究显示，利多卡因还具有抗炎效果，成为了脓毒症治疗研究中的一大热点［7］，但其作用机制尚不完全明确。核因子E2 相关因子2/血红素加氧酶1（nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase-1，Nrf2/HO-1）是重要的内源性抗氧化应激通路，与脓毒症急性肺损伤、心肌损伤等发生发展密切相关［8-10］，但关于利多卡因对脓毒症大鼠心肌损伤及Nrf2/HO-1 通路的影响尚鲜有研究。本项工作拟探究利多卡因对脓毒症大鼠心肌损伤及Nrf2/HO-1 通路的影响，以期揭示其作用机制，为脓毒症心肌损伤的治疗提供参考资料。

材料和方法

1 实验动物

7～8 周龄健康雄性SPF 级SD 大鼠45 只，体质量250～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2017-0005。本研究经过本院动物伦理委员会批准通过，符合中国实验动物制度伦理审查委员会关于动物实验的指导方针。

2 药品、主要试剂和仪器

碳酸利多卡因注射液（规格：5 mL∶86.5 mg）购自济川药业集团有限公司。丙二醛（malonaldehyde，MDA）检测试剂盒购自北京索莱宝莱科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis fac⁃tor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒、肌红蛋白（myoglobin，Myo）ELISA 试剂盒、心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac tropo⁃nin Ⅰ，cTnI）ELISA 试剂盒、高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）ELISA 试剂盒，Nrf2、HO-1、β-actinⅠ抗和Ⅱ抗羊抗兔IgG均购自Ab⁃cam。IX75 奥林巴斯光学显微镜购自OLYMPUS；MODEL 550型酶标仪购自Bio-Rad。

3 方法

3.1 脓毒症大鼠模型制备及分组 45只SD 大鼠随机分为3组：假手术（sham）组、模型（model）组和利多卡因（lidocaine）组，每组15 只。模型组和利多卡因组参考文献［11］采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症大鼠模型。腹腔注射2%戊巴比妥钠（60 mg/kg）进行麻醉，切口处常规消毒后，于下腹正中做约2 cm 纵切口，打开腹膜，迁出盲肠，结扎回盲瓣至盲肠游离端外2/3，并用针头穿透至少量肠内容物挤出，将盲肠还纳腹腔，关腹，并逐层缝合。术中监测大鼠呼吸、心电图及血氧饱和度。以大鼠出现竖毛、少尿、腹泻腹胀、肛温降低等症状并结合组织病理变化提示脓毒症大鼠模型制备成功。假手术组大鼠只打开腹腔后缝合，不进行盲肠结扎穿孔。造模后利多卡因组大鼠立即给予利多卡因10 mg/kg 负荷剂量注射，然后以10 mg·kg-1·h-1的剂量尾静脉输注3 h，假手术组和模型组用等量生理盐水代替。24 h 后进行血清及组织标本采集，检测相关指标变化。

3.2 ELISA 检测血清TNF-α、HMGB1、Myo 和cTnI水平 造模24 h 后采集大鼠尾静脉血，常规离心后分离血清，采用ELISA检测血清TNF-α、HMGB1、Myo及cTnI水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

3.3 TTC 染色法检测心肌组织梗死区面积 每组随机选5 只大鼠尾静脉注射1%伊文思蓝染料2 mL，待全身蓝染后，处死大鼠，取心脏组织快速置于液氮中，从心尖沿心脏短轴均匀切成1.5 mm 厚度的切片，置于1% TTC 溶液中37℃孵育10 min，10%甲醛中固定，拍照，采用ImageJ 软件测量梗死区、危险区面积，心肌梗死率（%）=梗死区面积/危险区面积×100%。

3.4 HE 染色检测心肌组织病理损伤变化 处死各组剩余10 只大鼠，取部分心肌组织置于4%多聚甲醛中固定，另取部分心肌组织置于液氮中保存备用。取固定24 h 后的心肌组织进行石蜡包埋、切片（5 μm），进行HE 染色，经显微镜观察心肌组织损伤病理变化。

3.5 生物化学法检测心肌组织MDA和SOD水平取部分心肌组织制备匀浆液（体积比1∶10），采用生物化学法检测MDA 和SOD 水平，具体步骤严格参照试剂盒说明书进行。

3.6 RT-qPCR 法检测心肌组织Nrf2 和HO-1 mRNA的表达水平 采用RNA 提取试剂盒提取各组心肌组织中RNA，紫外分光光度计检测其浓度及纯度。反转录得到cDNA，置于-20℃保存备用。RT-qPCR扩增Nrf2 和HO-1 mRNA。20 μL 反应体系：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TliRNaseH Plus）10.0 μL，ROX Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA（50 mg/L）2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反应条件：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40 个循环。采用2-ΔΔCt法定量分析心肌组织中Nrf2 和HO-1 mRNA的相对表达水平。

3.7 Western blot法检测心肌组织Nrf2和HO-1蛋白的表达量 提取各组大鼠心肌组织总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，置于-80℃保存备用。取50 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE，PVDF 膜转膜，室温封闭，添加Nrf2（1∶1 000）、HO-1抗体（1∶2 000）、β-actin抗体（1∶5 000），4℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜，添加Ⅱ抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育2 h，显色，曝光胶片，观察结果并分析蛋白灰度值。

4 统计学处理

采用SPSS 25.0 软件对实验数据进行统计学处理。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，多组数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 各组大鼠血清TNF-α和HMGB1水平比较

与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α 和HMGB1 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，利多卡因组大鼠血清TNF-α 和HMGB1 水平显著降低（P＜0.01），见图1。

2 各组大鼠心肌梗死率的比较

假手术组、模型组和利多卡因组大鼠心肌梗死率分别为0、（48.52±4.67）%和（41.23±4.15）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，利多卡因组大鼠心肌梗死率显著降低（P＜0.01），见图2。

3 各组大鼠血清Myo和cTnI水平比较

Figure 1.Comparsion of serum TNF-α（A）and HMGB1（B）levels of rats in each group.Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.图1 各组大鼠血清TNF-α和HMGB1水平比较

Figure 2.TCC staining of rat myocardium in each group.图2 各组大鼠心肌TCC染色图

与假手术组比较，模型组大鼠血清Myo和cTnI水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，利多卡因组大鼠血清Myo和cTnI水平显著降低（P＜0.01），见图3。

Figure 3.Serum Myo（A）and cTnI（B）levels of rats were com⁃pared in each group.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.图3 各组大鼠血清Myo和cTnI水平比较

4 各组大鼠心肌组织病理学变化

假手术组大鼠心肌纤维结构排列紧密，无明显异常；模型组大鼠心肌组织排列紊乱、细胞水肿、炎症细胞浸润、间质血管扩张充血，可见局灶性心肌坏死；利多卡因组大鼠心肌病理损伤减轻，见图4。

Figure 4.Morphological changes of myocardial pathology in each group（HE staining，scale bar=100 μm）.图4 各组大鼠心肌病理学形态变化

5 各组大鼠心肌组织MDA含量和SOD活性比较

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织MDA 含量显著升高，SOD 活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，利多卡因组大鼠心肌组织MDA 含量显著降低，SOD活性显著升高（P＜0.01），见图5。

Figure 5.Comparison of MDA content and SOD activity in myo⁃cardial tissue of rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.图5 各组大鼠心肌组织MDA含量和SOD活性比较

6 各组大鼠心肌组织Nrf2 和HO-1 mRNA 表达水平比较

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Nrf2 和HO-1 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，利多卡因组大鼠心肌组织Nrf2 和HO-1 mRNA表达水平进一步升高（P＜0.01），见图6。

7 各组大鼠心肌组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达量比较

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达量升高（P＜0.01）；与模型组比较，利多卡因组大鼠心肌组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达量进一步升高（P＜0.01），见图7。

讨论

Figure 6.Relative expression of Nrf2 and HO-1 mRNA in myo⁃cardial tissue of rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.图6 各组大鼠心肌组织Nrf2和HO-1 mRNA水平的比较

Figure 7.Relative protein expression of Nrf2 and HO-1 in myo⁃cardial tissue of rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.图7 大鼠心肌组织Nrf2和HO-1蛋白表达

本研究采用经典盲肠结扎穿孔法制备脓毒症大鼠模型，脓毒症发生时，大量炎症因子如TNF-α、HMGB1 及白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等释放可导致多器官损伤。TNF-α 是脓毒症发生发展的重要促炎因子，HMGB1 是一种普遍存在的核蛋白，可介导先天免疫反应，是脓毒症致死效应的关键炎症介质，脓毒症晚期单核/巨噬细胞和树突状细胞可在TNF-α 等炎症因子刺激作用下分泌HMGB1 等促炎因子，HMGB1 表达水平与脓毒症严重程度及预后高度相关［12-13］。脓毒症可导致多器官功能障碍，心脏是易受损器官之一，心肌损伤是导致脓毒症死亡率增加的重要原因之一。Myo 和cTnI 是心肌损伤标志物，其中Myo 是一种氧结合的血红蛋白，主要存在于骨骼肌和心肌，对心肌损伤具有较高的敏感性。cT⁃nI 特异存在于心肌细胞中，心肌细胞损伤时释放入血，且持续时间较长。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α 和HMGB1 水平、大鼠心肌梗死率、血清Myo 和cTnI水平显著升高，提示脓毒症心肌损伤大鼠制备成功。而利多卡因可降低脓毒症心肌损伤模型大鼠血清TNF-α、HMGB1、Myo 和cTnI 水平，减轻心肌病理损伤，减少心肌梗死面积。利多卡因是一种临床常用药，具有价格低廉、抗炎、抗细胞损伤等作用，还可加快术后康复、促进抗癌细胞增殖等作用，持续静脉泵注射可有效降低脓毒症大鼠炎症因子TNF-α 和HMGB1 表达，抑制肺组织HMGB1 表达，减轻脓毒症肺损伤，提高动物存活率［14］，提示利多卡因可抑制脓毒症心肌损伤大鼠炎症因子表达，减轻炎症反应及心肌梗死损伤程度，与郭志佳等［15］研究报道结果一致。

氧化应激反应过度激活是引起心肌损伤的重要环节，其中Nrf2/HO-1 通路是抗氧化应激反应的重要信号通路之一，Nrf2 是重要抗氧化因子，生理条件下，Nrf2 与Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch like epichlorohydrin associated protein 1，Keap1）相偶联处于抑制状态，氧自由基可刺激Nrf2增加并与Ke⁃ap1 解离，Nrf2 通过核转位进入细胞核与氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）启动HO-1、SOD 和GSH-PX 等抗氧化酶表达，启动抗氧化反应［16-17］。研究认为，促进Nrf2/HO-1 通路激活可保护心肌梗死后不良的心脏重构［18］，可能与促进下游SOD和GSH-PX等抗氧化酶表达，提高心肌抗氧化能力有关，而利多卡因减轻心肌损伤是否与该通路激活有关未见报道［19］。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织MDA 含量、心肌组织Nrf2 和HO-1 蛋白表达量显著升高，SOD 活性显著降低，可能与心肌损伤后机体出现自身代偿使Nrf2/HO-1 通路激活有关［20］；利多卡因可显著降低脓毒症心肌损伤大鼠心肌组织MDA 含量，增加SOD 活性及心肌组织Nrf2 和HO-1 表达水平，与文献报道一致，提示利多卡因可能对Nrf2/HO-1 通路激活有促进作用，进而减轻脓毒症大鼠心肌损伤，提高其抗氧化应激能力。

综上所述，利多卡因可减轻脓毒症大鼠心肌损伤，其机制可能与促进Nrf2/HO-1 通路激活，提高心肌细胞抗氧化应激能力有关。但本项工作只是初步探究了利多卡因抗脓毒症心肌损伤的作用机制，关于其对Nrf2/HO-1 下游炎症相关信号通的影响尚不完全明确，有待深入研究。