一测多评法同时测定小儿黄龙颗粒中5种木脂素成分

刘晶，游龙泰，蔡梦如，张志勤，白杰，姚宇，吴慧敏，倪健（北京中医药大学，北京 100029）

小儿黄龙颗粒是经国家食品药品监督管理总局批准上市的一款治疗注意缺陷与多动障碍（attention deficit and hyperactivity disorder，ADHD）的中药复方颗粒。它由熟地黄、白芍、麦冬、知母、五味子、煅龙骨、煅牡蛎、党参、石菖蒲、远志及桔梗11 味中药组成。而目前关于小儿黄龙颗粒的研究仅限于临床试验和药理实验[1-10]，其质量标准和药物作用机制领域还有待开发。现已有研究将五味子中的木脂素类成分用于ADHD 的治疗[11]，同时这类成分被证明对神经系统具有保护作用，并能改善患者认知能力和记忆能力[12]，所以具有较高的单独研究价值。而小儿黄龙颗粒作为上市药品已在临床试验中证明其对于ADHD 的疗效，故本试验选取这5 个含量相对较高、且有研究证明其神经保护性的木脂素类成分建立含量测定方法。并选择容易获取，价格相对低廉的五味子醇甲作为内参物，建立同时测定五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙5 种成分的一测多评法（QAMS），实现该药物质量评价的进一步延展。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津）；KQ5200DA 型数控超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；Sartorius BT 125D 电子天平（德国赛多利斯集团）；G20 型高速医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；旋转蒸发器RE-52AA（上海振捷实验有限公司）。乙腈、甲醇（色谱级，Fisher Scientific）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；正己烷、甲醇（分析纯，天津市大茂化工厂）；磷酸（分析纯，北京化工厂）；小儿黄龙颗粒（重庆希尔安药业有限公司，批号：190701）；对照品五味子醇甲（批号：Y13D8H5095）、戈米辛D（批号：M05J9S65019）、五味子醇乙（批号：P4N10F103016）、当归酰基戈米辛H（批号：P17J9F65870）、五味子酯乙（批号：P07M6S1）（上海源叶生物科技有限公司，HPLC ≥98%）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇-乙腈（2∶1）（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～30 min，50%→65%A；30 ～58 min，65%～70%A）流速0.8 mL·min－1，柱温40℃，波长254 nm，进样量10 μL。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备

取一定量的五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙对照品，制成质量浓度为137.68、19.20、43.20、29.72、8.64 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.3 样品溶液制备

取小儿黄龙颗粒1 g，用5 mL 纯净水振摇溶解，再加入50 mL 正己烷，充分搅拌后超声提取60 min（超声功率200 W，40 Hz），用正己烷补足失重，6000 r·min－1，离心10 min，取上层澄清溶液放入鸡心瓶内，40 ℃减压浓缩至干，用甲醇复溶定容至10 mL 量瓶中。溶液过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液进样。

图1 小儿黄龙颗粒样品的HPLC 图Fig 1 HPLC chromatogram of Xiaoer Huanglong granule

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，逐级稀释，进样测定，以对照品质量浓度为横坐标X（μg·mL－1），峰面积为纵坐标Y，求得线性回归方程，结果见表1。

表1 5 种木脂素成分的线性关系考察Tab 1 Linear relation of 5 lignans

2.4.2 精密度试验 取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙峰面积RSD值分别为0.070%、0.30%、0.060%、0.43%、0.20%，出峰时间的RSD值分别为0.32%、0.24%、0.19%、0.12%、0.070%。

2.4.3 稳定性试验 取同一份样品溶液（批号：190701），按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、16、18、24 h进样。五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙峰面积RSD值分别为2.7%、2.4%、2.0%、3.5%、1.5%，出峰时间的RSD值分别为0.35%、0.32%、0.30%、0.21%、0.23%。

2.4.4 重复性试验 取同一批（批号：190701）小儿黄龙颗粒，按“2.3”项下方法制备6 份样品，分别精密吸取10 μL 进样。测得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙平均含量的RSD值分别为2.3%、1.9%、2.2%、2.6%、0.82%。

2.4.5 加样回收试验 取同一批（批号：190701）小儿黄龙颗粒（五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙含量分别为0.215、0.028、0.056、0.038、0.021 mg），再加入含量相近的5 种对照品（五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙含量为0.219、0.029、0.057、0.038、0.021 mg），按“2.3”项下方法制备6 份样品，分别精密吸取10 μL 进样。测得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙平均回收率为96.7%、102.2%、95.9%、100.5%、102.9%，其RSD值分别为3.6%、2.8%、2.9%、1.7%、3.7%。

2.5 相对校正因子的计算

根据相对校正因子计算公式：fi/s＝fi/fs＝（Ci/Ai）/（Cs/As）＝（Ci×As）/（Cs×Ai），以多点校正法进行计算。选定五味子醇甲为内参物，则fi、Ci、Ai分别为五味子醇甲的相对校正因子、浓度及峰面积，而fs、Cs及As则为待测成分的校正因子、浓度及峰面积，同时选取“2.4.1”项下线性系列浓度与峰面积进行计算。可得戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙的校正因子为1.414、1.094、0.926、1.031，RSD值分别为1.4%、0.69%、2.9%、2.5%。

2.6 QAMS 系统耐用性考察

2.6.1 波长对相对校正因子的影响 分别考察检测波长252、254、256 nm 对相对校正因子的影响，结果戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙的相对校正因子平均值分别为1.398、1.088、0.939、1.030，RSD值分别为1.9%、0.98%、3.0%，1.9%。表明波长对戈米辛D、五味子醇乙、五味子酯乙的相对校正因子无影响，相较之下对当归酰基戈米辛H 会产生一定影响。

2.6.2 柱温对相对校正因子的影响 分别考察柱温30、35、40℃对相对校正因子的影响，结果戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙的相对校正因子平均值分别为1.405、1.093、0.940、1.042，RSD值分别为0.68%、0.080%、1.5%、0.91%，表明温度对相对校正因子无影响。

2.6.3 流速对相对校正因子的影响 分别考察0.7、0.8、0.9 mL·min－1流速对相对校正因子的影响，结果戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙的相对校正因子平均值分别为1.413、1.095、0.939、1.042，RSD值分别为0.21%、0.11%、1.2%、0.86%，表明流速对相对校正因子无影响。

2.6.4 色谱柱对校正因子的影响 分别考察Waters XTERRA RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）4 种型号色谱柱对戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙的相对校正因子的影响。测得其平均值分别为1.414、1.096、0.945、1.045，RSD值分别为0.54%、0.19%、1.4%、0.88%，表明色谱柱的型号对相对校正因子无影响。

2.7 待测组分色谱峰定位

采用比较相对保留时间（以五味子醇甲为内参物）的方法对5 种木脂素成分进行定位，分别考 察Waters XTERRA RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Phenomenex luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）4 种型号色谱柱对相对保留时间的影响，测得戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙的相对保留时间的平均值分别为1.154、1.277、1.456、1.911，RSD值则分别为4.2%、4.0%、2.3%、4.4%。

2.8 QAMS 与外标法结果的比较

外标法测得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙平均含量为0.325、0.042、0.085、0.057、0.031 mg·g－1，QAMS 测得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙平均含量分别为0.325、0.042、0.084、0.057、0.031 mg·g－1，对两组数据进行t检验，P＝0.156，结果无显著性差异，显示QAMS 准确可行。具体结果见表2。

表2 一测多评与外标法测定结果比较Tab 2 QAMS method compared with the external standard method

3 讨论

在条件摸索时发现常规的有机相甲醇或乙腈溶液在本试验中分别会导致色谱峰分离度差和拖尾严重，故采取抽滤超声混合后甲醇、乙腈比例为 2∶1 的溶液作为有机相。酸度较低的水相则存在色谱峰分离度较差的问题，对比了0.3%、0.5%、1%甲酸水溶液，0.1%醋酸水溶液和0.1%、0.2%磷酸水溶液的谱图，最终选取了0.2%磷酸水溶液作为水相。提取溶剂对比了70%、80%乙醇，甲醇和正己烷的效果，发现除了正己烷，采用其他溶剂提取后都会在5 min 之前出现大的杂峰，故选取了正己烷作为提取溶剂。考察有机相的初始浓度为40%、45%、50%、55%、60%时发现50%的初始浓度可以让成分分离达到最佳效果。在前处理条件上比较了超声时间为30、45、60、120 min 的提取效果，其中60 min 为最优提取时间；考察了210、220、230、244、250、254、260、270、280、290、334 nm 波长下的谱图，综合考虑分离度和峰面积选取了254 nm 为波长条件；考察了25、50、100 倍提取溶剂的提取效果，确定50 倍即可提取完全；柱温的高低对分离度有所影响，在考察了30、35、40 ℃后，选取了40℃作为最终柱温条件；而高速离心和过滤都能达到除去杂质的效果，但离心更简便且在操作中过程中易于保证操作一致性，故选取高速离心进行除杂；同步考察色谱时间（50 ～100 min）和流速（0.35 ～1.0 mL·min－1）对综合效率和分离度的影响，最终选取了58 min 和0.8 mL·min－1作为色谱时间和流速。

在考察中发现提取容器的大小和种类并不会对提取率产生影响。由于五味子醇甲以外的4 种成分含量很低，在加样回收试验中出现直接加入微量对照品误差较大的问题，且甲醇和正己烷溶液直接混匀在搅拌和超声的过程中易出现浑浊影响提取率，所以，先配制和样品成分含量近似相等的混合对照品储备液，旋干后在同一容器中加入样品以制备加样回收试验的供试品溶液。在进行QAMS 系统耐用性考察时，参考文献[13]和2020年版《中国药典》四部[14]中分析方法验证指导原则的要求，选取了较小的试验条件变动范围。

现有文献中，通过退行性造模大鼠的行为学研究发现五味子醇甲可能通过抗氧化作用改善治疗阿尔茨海默病的症状[15]；采取液质联用技术和阿尔茨海默病模型大鼠的研究发现包含五味子醇甲、戈米辛D 及当归酰基戈米辛H 在内的8 种成分为生脉散中主要起神经保护作用的质量标志物成分[16]。另一项采取液质联用鉴定技术和抑郁症模型小鼠的研究则发现，五味子醇提物中包括五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯乙在内的14 种木脂素类成分可以上调与神经保护作用相关的BDNF、TrkB、CREB 信号通路[17]。所以从药理机制上推测，本研究中涉及到的这5 个成分有可能在小儿黄龙颗粒治疗ADHD 的过程中起到一定作用，因此，建立一套完整的多指标成分含量测定方法具有研究意义。在提高本方法实用性方面，考虑到当归酰基戈米辛H 和戈米辛D 对照品价格较贵，难以获取，故采用价格低廉的常见对照品五味子醇甲作为内参物，建立了QAMS 同时测定5 个成分的含量，填补了小儿黄龙颗粒质量标准的空白。