2种芳香化酶抑制剂和3种5型磷酸二酯酶抑制剂的电喷雾四极杆飞行时间质谱裂解规律研究

赖雅琳，武正华，缪文清，陈明，刘庆香，段华健，范国荣*，范琦*（.重庆医科大学药学院，重庆 40006；.上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海 00080）

治疗男性不育症是一个世界性的医学难题，目前缺乏疗效显著的药物。《中国男科疾病诊断治疗指南与专家共识》（2016年版）推荐芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitors，AIs）作为男性不育症的治疗药物，常用的AIs 为阿那曲唑和来曲唑[1]。近年来，5 型磷酸二酯酶抑制剂（phosphodiesterase-5 inhibitors，PDE5Is）西地那非和他达拉非也被用于经验性治疗男性不育症[2-4]。其中，西地那非的体内代谢产物N-去甲基西地那非也具有药理活性。上海交通大学附属第一人民医院泌尿男科李峥教授团队研究发现一次性按需口服西地那非可改善特发性少弱精子症患者的前向运动精子百分比和前向精子运动总数[5]。目前，该团队正在尝试联合使用AIs 与PDE5Is，以期改善男性不育症的疗效。

采用高分辨电喷雾四极杆飞行时间质谱（ESIQ-TOF/MS）法探究AIs 与PDE5Is 联合使用的体内过程，需要先研究这两类酶抑制剂的质谱裂解规律，以进一步开展其药效动力学研究。迄今为止，关于AIs 的质谱裂解规律，未见文献报道；关于PDE5Is 的质谱分析，文献报道主要集中于中药[6-7]或保健品[8-10]中非法添加物的快速鉴定，即仅限于对高离子强度特征碎片离子的归属分析。

本文采用ESI-Q-TOF/MS 正离子检测模式，对AIs（阿那曲唑和来曲唑）以及PDE5Is（西地那非、N-去甲基西地那非和他达拉非）共5 个化合物的特征碎片离子进行分析，并阐述它们的裂解过程，对已发现的特征碎片离子进行确证，对新发现的碎片离子进行归属分析，以探索新的裂解途径，总结质谱裂解规律，为AIs 与PDE5Is联合使用的体内过程以及药效动力学研究提供基础，并为两类酶抑制剂的结构解析及药效评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 Infinity 超高效液相色谱系统（配有二元泵、在线脱气机、自动进样器和柱温箱）、Agilent 6545 Q-TOF 质谱仪[配有电喷雾离子（ESI）源及Mass Hunter 在线分析软件]（美国Agilent 公司）；AUW220D 电子分析天平（日本Shimadzu公司）；MX-S 涡旋混合器（美国Scilogex 公司）；SK7200H 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Hitech 水纯化系统（上海和泰仪器有限公司）。

1.2 试药

阿那曲唑对照品（批号：100770-201302，纯度：99.7%，中国食品药品检定研究院）；来曲唑对照品（批号：A0610AS，纯度＞98%，大连美仑生物技术有限公司）；西地那非（批号：X23A8Y42189，纯度≥98%）、N-去甲基西地那非（批号：J16A10H95420，纯度：95%）、他达拉非（批号：Y20F8C29468，纯度≥99%）对照品（上海源叶生物科技有限公司），化学结构式如图1 所示。

甲醇（德国Merck 公司）、乙腈（美国TEDIA公司）、甲酸（美国ACS 公司）均为色谱纯，水为去离子水（自制）。质谱所用参比液与调谐液均由美国Agilent 公司提供。

图1 阿那曲唑、来曲唑、西地那非、N-去甲基西地那非和他达拉非的化学结构式Fig 1 Chemical structures of anastrozole，letrozole，sildenafil，N-desmethylsildenafil and tadalafil

2 方法

2.1 UPLC-ESI-Q-TOF/MS 法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；柱温为25℃；流动相为0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min，20%～90%B；1～2 min，90%B；2～2.1 min，90%～20%B；2.1～3 min，20%B）；流速为0.4 mL·min－1；进样量为5 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子（ESI）源，正离子模式，毛细管电压为4000 V，雾化器压力为35 psi，干燥气（N2）流速为8 L·min－1、温度为320 ℃，鞘气（N2）流速为11 L·min－1、温度为350℃；碎裂电压为175 V；锥孔电压为65 V；喷嘴电压为500 V。扫描范围为m/z100 ～500；扫描方式为自动一级质谱全扫描和手动二级质谱提取离子扫描；碰撞电压为20 ～60 eV。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取阿那曲唑、来曲唑、西地那非、N-去甲基西地那非和他达拉非对照品各适量，分别用甲醇溶解并稀释制得1 mg·mL－1的对照品储备液，4℃冰箱保存备用。精密量取上述各对照品储备液适量，分别用50%甲醇溶液稀释即得50 ng·mL－1的对照品溶液。

3 结果与分析

3.1 一级质谱分析

在正离子一级全扫描质谱中，5 个化合物均以[M ＋H]＋准分子离子峰为基峰，且均有较强的响应，其一级提取离子流色谱图如图2 所示。

3.2 二级质谱分析

对于阿那曲唑和来曲唑，将碰撞电压优化至20 ～50 eV；对于西地那非、N-去甲基西地那非和他达拉非，将碰撞电压优化至30 ～60 eV。分别对5 个化合物的准分子离子进行碰撞诱导解离（collisional-induced dissociation，CID），利用质谱图累加采集（multiple cycle accumulation，MCA）技术将不同碰撞电压下产生的系列碎片离子峰叠加为一张质谱图，以直观观察二级质谱碎片离子峰，从而获得精确质量的质谱碎片信息。

图2 阿那曲唑、来曲唑、西地那非、N-去甲基西地那非和他达拉非的一级提取离子流色谱图Fig 2 Extracted ion chromatograms of anastrozole，letrozole，sildenafil，N-desmethylsildenafil and tadalafil

3.2.1 芳香化酶抑制剂的质谱裂解规律分析 阿那曲唑的准分子离子[M ＋H]＋m/z为294.1726，对其进行CID 得到二级质谱数据，如图3 所示。可以观察到m/z225.1400 碎片离子强度最高，与准分子离子在质量数上相差69.0326，根据精确质量计算结合结构分析，可以确定是H＋离子加合在三氮唑的一个碱性N 原子上，C-N 键发生断裂的同时正电荷中心转移脱三氮唑中性碎片而形成，该碎片离子结构中的苄基正离子会通过扩环异构化形成共振杂化体的七元环䓬鎓离子使体系趋于稳定[11]，因此成为离子强度最高的碎片。当碰撞电压增大时，观察到其他碎片离子的出现，认为是七元环䓬鎓离子缩环重排构成一个苄基连接叔碳的结构，以此结构继续裂解。总体存在两条裂解途径，第一条途径是依次脱叔碳上的取代基，取代基中优势脱CH3，连接CH3的C-C 键均发生均裂脱CH3自由基，其次是苄基H 原子经五元环过渡态重排至N 原子上后脱HCN，从而得到m/z210.1157、m/z195.0924、m/z168.0813 碎片离子；m/z209.1082 碎片离子与m/z210.1157碎片离子在质量数上相差1.0075，推测是后者脱H 自由基形成的共轭结构。第二条途径是苄基与叔碳之间的C-C 键发生均裂脱C4H6N 自由基得到m/z157.0889 碎片离子，此时形成的苄基结构同前述原理扩环重排后进而裂解得到m/z142.0657、m/z130.0779、m/z115.0547 碎片离子；观察到m/z129.0703 碎片离子与m/z130.0779 碎片离子强度相同，质量数上相差1.0076，推测是后者发生分子内重排并脱H 自由基而形成的稳定结构。阿那曲唑可能的裂解途径如图4 所示。

图3 阿那曲唑的二级质谱图Fig 3 MS/MS spectrum of anastrozole

来曲唑的准分子离子[M ＋H]＋m/z为286.1089，对其进行CID 得到二级质谱数据，如图5 所示。可以观察到准分子离子峰消失，反而出现m/z为288.2897 的离子峰，推测是来曲唑结构中的三氮唑易受碰撞诱导影响发生加氢反应，进而出现的[M ＋2 ＋H]＋峰，随后以此结构进行裂解。同阿那曲唑相似，来曲唑先脱三氮唑中性碎片得到m/z217.0757 碎片离子；随后苯环邻位H 原子经五元环过渡态重排至N 原子上脱HCN 得到m/z190.0647 碎片离子；另外，观察到m/z215.0598 碎片离子，与m/z217.0757碎片离子在质量数上相差2.0159，认为是两个苯环相邻H 原子以自由基的形式脱落进而形成“芴”的结构。除此之外，从图5 中还观察到m/z106.0862 碎片离子强度最高，推测是[M ＋2 ＋H]＋m/z288.2897离子C-C 键发生异裂后经[C7H4N＋/C10H10N4]离子/中性复合物介导氢迁移反应丢失C10H6N4中性碎片而形成[12]。来曲唑可能的裂解途径如图6 所示。

图4 阿那曲唑可能的质谱裂解途径Fig 4 Possible fragmentation pathway of anastrozole

图5 来曲唑的二级质谱图Fig 5 MS/MS spectrum of letrozole

3.2.2 5 型磷酸二酯酶抑制剂的质谱裂解规律分析 西地那非与N-去甲基西地那非的准分子离子[M ＋H]＋m/z分别为475.3250、461.1968，对其进行CID 得到二级质谱数据，如图7 所示。现有文 献[7，13]已 归 属m/z377、m/z311、m/z299、m/z283、m/z255、m/z227、m/z166、m/z99 特征碎片离子，本研究经过高分辨质谱还获得了西地那非低质量区其他特征碎片离子，尚未见文献报道。从图7 中可以观察到西地那非与N-去甲基西地那非在中质量区的特征碎片离子基本一致，但在低质量区的碎片离子差异明显。分析发现西地那非和N-去甲基西地那非总体存在3 条裂解途径。由于结构中的磺酰基含有的两个O 原子具有很强的吸电子作用，导致 N-S 与C-S 键均不稳定，易发生断裂，因此第一条途径为哌嗪环上的H 原子经五元环过渡态重排至O 原子上并发生N-S 键断裂脱哌嗪结构得到m/z377.1273（m/z377.1292）碎片离子；紧接着C-S 键发生断裂脱H2SO2得到m/z311.1498（m/z311.1508）碎片离子，这与二级质谱数据中m/z377 碎片离子强度较低相吻合；随后苯环烷氧基末端H 原子经四元环重排至O 原子上脱C2H4得到m/z283.1186（m/z283.1190）碎片离子；以此结构脱CO 得到m/z255.1229（m/z255.1248）碎片离子，该脱落过程有两种可能，梁祈[14]认为是苯环开环脱CO，而高青等[15]认为是C-7 位脱CO；从图7 中观察到西地那非m/z119.0853 碎片离子强度较高，推测是C-7 位脱CO 后接着C-N 键断裂脱吡唑结构得到m/z135.0801 碎片离子，此碎片离子不稳定继续脱NH2自由基而形成；m/z102.1275 碎片离子与m/z119.0853 在质量数上相差16.9578，提示苯环上OH 自由基的脱落；还观察到西地那非m/z107.0856 质谱碎片信号，推测是苯环开环脱CO 后C-7 位继续脱CO 和吡唑结构而形成。第二条途径为磺酰基上的O 原子经四元环重排至苯环邻位并发生C-S 键断裂，接着O-S 键断裂脱C5H12N2OS 中性碎片形成m/z为327 的过渡离子，随即脱C2H4或CO 得到m/z299.1129（m/z299.1133）碎片离子，于泓等[13]认为是苯环烷氧基重排脱C2H4，而梁祈[14]认为是苯环开环脱CO。第三条途径为C-5 与N-4位、C-7 与N-6 位之间均发生断裂脱C14H19N3O3S（C13H17N3O3S）中性碎片得到m/z166.0972（m/z166.0975）碎片离子。除此之外，观察到西地那非m/z100.0993 碎片离子，推测是N-S 键发生异裂后经[C17H19N4O4S＋/C5H12N2]离子/中性复合物介导电子迁移丢失C17H19N4O4S 自由基而形成。西地那非和N-去甲基西地那非可能的裂解途径如图8 所示。

图6 来曲唑可能的质谱裂解途径Fig 6 Possible fragmentation pathway of letrozole

图7 西地那非（A）和N-去甲基西地那非（B）的二级质谱图Fig 7 MS/MS spectra of sildenafil（A）and N-desmethylsildenafil（B）

他达拉非的准分子离子[M ＋H]＋m/z为390.1448，对其进行CID 得到二级质谱数据，如图9 所示。现有文献[6，9，15]已归属m/z268、m/z262、m/z250、m/z240、m/z224、m/z197、m/z169、m/z135 特征碎片离子，本研究经过高分辨质谱获得的主要特征碎片离子集中在低质量区，未见文献报道。从图9 中观察到准分子离子峰消失，出现m/z373.1857 碎片离子，提示酮式结构不稳定，易发生酮式-烯醇式互变后脱OH 自由基，因此得到离子强度较高的m/z373.1857 质谱碎片信号，随后以此结构进行裂解。首先，观察到m/z173.0807 碎片离子强度最高，推测是C-6 位与苯环之间发生均裂脱C7H5O2自由基形成m/z252 的过渡离子，随即发生分子内重排脱CO 和丙炔腈中性碎片而形成。另外，C-6 位与N-5 位、吡咯环之间均发生断裂脱C8H7O2自由基形成m/z238 的过渡离子，随即发生分子内重排脱CO 和丙腈中性碎片，与离子强度较高的m/z155.0702 碎片离子吻合；接着脱CN 自由基得到m/z129.0547 碎片离子；观察到m/z101.0596 质谱碎片信号，提示亚胺甲烷自由基的脱落。除此之外，还观察到m/z111.0440 碎片离子，认为是C-6 与N-5 位、C-12 与C-12a 位之间均发生断裂脱C17H12NO2自由基而形成。他达拉非可能的质谱裂解途径如图10 所示。

图8 西地那非（R ＝CH3）和N-去甲基西地那非（R ＝H）可能的质谱裂解途径Fig 8 Possible fragmentation pathways of sildenafil（R ＝CH3）and N-desmethylsildenafil（R ＝H）

图9 他达拉非的二级质谱图Fig 9 MS/MS spectrum of tadalafil

4 讨论

本文采用m/z100 ～500 的扫描范围对2 种AIs（阿那曲唑和来曲唑）以及3 种PDE5Is（西地那非、N-去甲基西地那非和他达拉非）进行正负离子一级全扫描，结果显示5 个化合物在正离子模式下响应均较高，而在负离子模式下无响应或响应较低，推测其可能的原因是5 个化合物均含有未共轭的N 原子，这些N 原子上的孤对电子具有较强的供电子能力，易加合H＋离子，因此选择正离子模式检测。此外，优化流动相时比较了水-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈和2 mmol·L－1乙酸铵溶液-乙腈，发现在正离子模式下，流动相中加入酸可显著提高离子化效率和灵敏度，最终选择0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相。

图10 他达拉非可能的的质谱裂解途径Fig 10 Possible fragmentation pathways of tadalafil

本文得到的他达拉非的主要特征碎片离子信息与文献[6，9，15]报道不一致，其准分子离子不稳定，易通过酮式-烯醇式互变后脱OH 自由基得到m/z373.1857 碎片离子，再继续裂解，其可能的原因是酮式-烯醇式互变后，O 原子的孤对电子易使其加合H＋离子，诱导C-O 键异裂形成[C22H18N3O3＋/H2O]离子/中性复合物，进而介导氢迁移反应脱OH 自由基。该新的裂解方式可为他达拉非的进一步研究提供参考。