基于HT-29细胞的枳壳治疗结肠肿瘤药效物质组分提取工艺研究

罗曦，李天娇，2，3，包永睿，2，3，王帅，2，3，孟宪生，2，3*（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 6600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600）

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，归脾、胃经，具有理气宽中、行滞消胀的功效[1]，最早记载于南北朝《雷公炮炙论》[2]，主要含有黄酮类、挥发油类、香豆素类和生物碱类等化学成分[3]，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性[4]。结肠癌是消化道肿瘤中常见的恶性肿瘤，中医理论认为，“邪之所凑，其气必虚”，脾胃虚弱是结肠癌的病理基础，西医治疗方法手术和化疗可能会进一步损伤脾胃功能，故中医药治疗结肠癌以健脾理气为主要方法[5]。据文献报道，中医临床治疗结肠癌的处方中经常出现理气药枳壳[6-8]，但其抗结肠肿瘤方面的相关研究较少。本实验基于人结肠癌细胞HT-29 体外药效实验，通过正交实验设计，以HT-29 细胞抑制率为指标，对枳壳治疗结肠肿瘤药效物质组分的提取工艺进行筛选，并结合层次分析法，优选可代替药效指标综合评分的权重系数，以期为枳壳合理利用、药效物质基础及作用机制研究提供前期基础。

1 材料

1.1 仪器与试药

UV-1750 型紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；HSS 型电子恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；YJ-200A 型高速中药粉碎机（亿健品牌）；JE1002 电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；Mettler Toledo ME55 分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；CO2培养箱（德国NUAIRE 公司）；倒置显微镜（德国麦克奥迪公司）；酶标仪（美国Molecular Drvices 公司）；枳壳药材（亳州市康美中药有限公司，批号：20200716，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究所，批号：100080-201418，供含量测定用）；无水乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；胎牛血清、McCoy’s 5A 培养基、胰蛋白酶（美国GIBCO 公司）；青霉素/链霉素溶液、CCK-8 增强型溶液（Meilunbio 公司）。

1.2 细胞瘤株

人结肠癌细胞HT-29（中国科学院上海生命科学研究院细胞库）。

2 方法与结果

2.1 枳壳黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，用无水乙醇溶解稀释成质量浓度为0.15 mg·mL－1的对照品溶液，备用。

2.1.2 检测波长的选择 采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 比色法[9]，精密吸取芦丁对照品溶液2 mL置于10 mL 量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠溶液0.50 mL，振摇后静置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液2 mL，加30%乙醇至刻度，混合摇匀，静置15 min。不加芦丁对照品按照以上方法制备空白对照，在400 ～750 nm 波长下进行扫描，结果对照品溶液在510 nm 处有最大吸收，故确定510 nm 为检测波长。

2.1.3 标准曲线的建立 精密吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 芦丁对照品溶液，置于10 mL量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠溶液0.50 mL，振摇后静置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min，再加入4% 氢氧化钠溶液2 mL，加30% 乙醇至刻度，混合摇匀，静置15 min。在 510 nm 波长处测定吸光度，以芦丁含量为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝0.0011X－0.0069（r＝0.9996）。结果显示，芦丁在 0 ～600 μg·mL－1内与吸光度A呈现良好的线性关系。

2.2 HT-29 细胞培养及抑制率检测

2.2.1 细胞培养 人结肠癌细胞HT-29，按贴壁细胞培养方法，接种于含体积分数为10%胎牛血清、1% 双抗的McCoy’s 5A 培养基中，在温度为 37 ℃、5% CO2、湿度为70%～80%的条件下常规培养。隔日换液、传代，取对数生长期细胞做后续实验。

2.2.2 CCK-8 法检测细胞抑制率 取对数生长期的人结肠癌细胞HT-29，用含0.25% EDTA 的胰蛋白酶消化，以 7500 cell /孔的密度接种于96 孔板，设调零孔、空白孔和加药实验孔。于37℃、5% CO2、湿度为70%～80% 的条件培养24 h 后，加药实验组加入样品溶液100 μL，空白对照组加入等体积培养液（每组5 个复孔），继续培养24 h 后，采用CCK-8 法，用酶标仪在450 nm 处扫描，测定吸光度（OD）。计算药物对细胞的增殖抑制率，细胞抑制率＝（1－实验组OD值/对照组OD值）×100%。

2.3 枳壳黄酮提取工艺考察

2.3.1 乙醇浓度单因素考察 对水、30%、50%、75%、95% 乙醇进行考察，结果黄酮含量分别为3.42%、4.01%、4.99%、5.39%、5.02%。表明75%乙醇对枳壳黄酮类成分的提取率最高，因此选用75%乙醇作为最佳提取溶剂。

2.3.2 正交设计 根据预实验及参考文献[10]，取枳壳适量，60℃下烘干后粉碎，精密称取9 份过40目的枳壳药材粉末，每份5 g，采用75%乙醇为提取溶剂进行提取，选择溶剂用量（A）、提取时间（B）、提取温度（C）作为影响因素，每个因素取3个水平，进行L9（34）正交实验。因素水平见表1。精密称取9 组正交实验获得的提取物粉末，配制成0.01 g（生药）·mL－1浓度的含药培养液，作用于HT-29 细胞，以细胞抑制率为指标，优选提取工艺，正交结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平Tab 1 Factor and level

表2 正交设计直观分析Tab 2 Orthogonal design visual analysis

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

以人结肠癌HT-29 细胞抑制率为指标，直观分析及方差分析影响提取工艺的因素顺序为A ＞B ＞C，其中溶剂用量（A）、提取时间（B）对细胞抑制率影响较大（P＜0.05），为主要因素；提取温度（C）影响较小。由于提取时间（B）也是影响提取工艺的主要因素，故为验证优选提取时间的准确性，在其他提取条件均为最优时，对其进行单因素考察。分别对2、2.5、3 h 进行单因素考察，发现细胞抑制率分别为 77.04%、79.17%、79.51%，为提高生产效率，确定提取时间为2.5 h。综上所述，结合抑制率结果筛选出最佳提取条件为A2B2C2，即25 倍量75%乙醇，在75℃下提取2.5 h。

2.4 层次分析法对黄酮含量和出膏率权重系数的确定

以黄酮含量和出膏率为指标，评价枳壳治疗结肠肿瘤药效物质组分的提取工艺，建立评价目标模型，结果见图1。

图1 枳壳治疗结肠肿瘤药效物质组分提取工艺评价模型Fig 1 Evaluation model of extraction process of effective components from Fructus aurantii for colon tumor

通过比较同一层次目标（黄酮含量和出膏率）的相对重要程度，构成一系列两两比较矩阵。利用Analytic Hierarchy Process（AHP）软件，计算权重系数随机一致性比率CR（CR＝CI/RI），其可作为衡量所得权重系数是否合理的指标，得到9 组CR＝0.0000 ＜0.1，即认为矩阵具有满意的一致性，表明9 组权重系数合理有效，可用于提取工艺优选的综合评分中，见表4。

表4 两种指标在不同重要程度下的权重系数Tab 4 Weight coefficient of two indexes in diffrent importance degree

按照各指标不同的权重系数来计算综合评分，作为提取工艺的评价指标，以“比较重要”为例，实验设计和结果见表5 和表6 [综合评分1 ＝（黄酮含量/最大黄酮含量）×0.8333 ＋（出膏率/最大出膏率）×0.1667；综合评分2 ＝（黄酮含量/最大黄酮含量）×0.1667 ＋（出膏率/最大出膏率）×0.8333]。

以综合评分1 为指标，直观分析及方差分析影响提取工艺的因素顺序为A ＞B ＞C，其中溶剂用量（A）影响最大（P＜0.05），为主要影响因素。提取时间（B）和提取温度（C）无显著影响，而且 B2 和B3，C2 和C3 结果相差不大，从提高生产效率和节约能源角度考虑，确定提取时间为2.5 h，提取温度为75℃。

表5 正交实验设计及直观分析结果Tab 5 Orthogonal experiment design and visual analysis

表6 方差分析Tab 6 Analysis of variance

以综合评分2 为指标，直观分析及方差分析影响提取工艺的因素顺序为 C ＞A ＞B，其中提取温度（C）影响最大（P＜0.05），溶剂用量（A）和提取时间（B）差异无统计学意义（P＞0.05）。从提高生产效率和节约溶剂角度考虑，优选出的工艺条件为A1B1C3，即20 倍量75%乙醇，在80℃下提取2 h。

当黄酮含量和出膏率的权重系数分别为0.8333、0.1667 时，以综合评分1 与细胞抑制率为指标优选的最佳提取条件一致，说明在此权重系数下，两者的综合评分可代替细胞抑制率，作为枳壳治疗结肠肿瘤药效物质组分提取工艺的考察指标。当权重系数为0.1667、0.8333 时，以综合评分2 为指标优选的最佳提取条件与以细胞抑制率为指标优选出的提取工艺不一致。

同时，对其他权重系数计算综合评分，进行正交实验直观分析和方差分析，得到黄酮含量和出膏率最佳的权重系数范围分别为0.75 ～0.90、0.10 ～0.25。在此权重系数范围内，其综合评分可代替细胞抑制率，作为提取工艺的考察指标。

2.5 验证实验

平行称取3 份等量药材，按照优选出的最佳提取工艺，即25 倍量 75% 乙醇，在75℃水浴条件下，回流提取 2.5 h，进行提取。黄酮含量分别为6.106%、6.127%、6.149%，出膏率分别为25.92%、25.99%、25.86%，细胞抑制率分别为73.92%、74.08%、74.15%，3 项指标的RSD分别为0.35%、0.25%、0.18%，说明优选的工艺条件稳定可行，且体外药效稳定。选取2 个权重系数范围内外的数值，对其综合评分与细胞抑制率进行Pearson 相关性分析[11-14]，确定权重系数范围的准确性和合理性，结果见表7。

表7 权重系数范围验证结果Tab 7 Validation of weight coefficient range

根据前面得出的黄酮含量和出膏率最佳的权重系数范围，通过Pearson 相关性分析可知，在确定的权重系数范围内（组别1），综合评分与细胞抑制率的相关系数较大；在权重系数范围外（组别2），相关系数较小，说明黄酮含量和出膏率的权重系数范围合理。

3 讨论

枳壳为健脾理气、宽肠行滞的常用药，同时具有抗炎、抗氧化以及抗肿瘤等药理作用，常被加入“健脾理气法”治疗结肠癌的中药处方中使用。目前尚无其在抗结肠肿瘤药效物质组分提取工艺方面的报道，因此本实验对其进行研究，为开发以枳壳为原料的抗肿瘤新药提供实验依据和理论基础。

中药化学成分复杂，且各化学物质组之间相互影响，因此药效物质组的含量与药效之间不呈线性相关。若单以药效物质组分的含量为提取工艺的考察指标，不能保证所选提取工艺的提取物达到最佳药效；若单以细胞抑制率结果为评价指标，虽能保证药效，但操作繁琐费时。因此，本实验针对中药化学成分的特点，运用层次分析法[15-18]，将枳壳治疗结肠肿瘤药效物质组分提取工艺的评价指标构成单层次、两指标体系，在主观判断的基础上进一步处理，使其在权重系数的赋予上更加科学、合理，同时建立黄酮含量、出膏率与药效的关联，即通过细胞抑制率结果为指标的正交实验结果，筛选出代替细胞抑制率的黄酮含量和出膏率综合指标的权重系数及其范围。本实验筛选出了影响提取工艺的主要和次要因素，避免了赋予权重系数的偶然性，不但能确保提取物的药效，且避免了复杂的操作，使工艺更加合理可行。通过Pearson 相关性分析可知，在权重系数范围内，其综合评分可代替药效指标，作为其抗肿瘤药效物质组分提取工艺的评价指标。

本实验以综合评价指标代替药效，对枳壳治疗结肠肿瘤的药效物质组分提取工艺进行研究可为其合理开发和利用奠定基础，为其治疗结肠肿瘤的药效物质基础及作用机制研究提供理论依据。