3种改性方法对琼胶理化性质的影响

王露楠 ，杨少玲，戚 勃，杨贤庆，李春生，马海霞，胡 晓

（1. 上海海洋大学食品学院，上海 201306； 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所/国家水产品加工技术研发中心/农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州 510300）

琼胶是一种天然的高分子多糖，存在于石花菜科、江蓠科等海洋藻类的细胞壁中[1]，其主链由1,3-β-D-半乳糖和 1,4-3,6 内醚-α-L-半乳糖交替连接而成，同时含有少量的硫酸基、甲氧基和丙酮基等基团[2]。琼胶因其良好的凝胶性能、凝胶温度滞后性和生物活性被广泛应用于食品、生物和医药等领域[3]。然而，天然琼胶存在分子量大，溶解性能、溶液澄清度和透明度不高等缺陷，应用范围受到很大限制。冷饮食品行业需要低温速溶的琼胶[4]；微生物检验行业需要高透明、高澄清性能的琼胶[5]；搅拌混合型物料加工中需要耐机械剪切性能的琼胶[6]，但天然琼胶并不具备应用市场所需求的这些功能特性。因此，对琼胶进行适当的改性研究，赋予其新的理化性能，是解决琼胶应用缺陷的主要方法[7]。

研究表明，通过化学改性取代琼胶分子上的活性羟基，琼胶的理化性质、分子结构和稳定性会发生改善，从而具备更好的理化性质和功能特性，以满足不同行业对琼胶的特殊需求[8-9]。近年来，许多学者对天然淀粉高分子的物理或化学改性做了大量研究，开发出不同理化特性的改性淀粉，并得到了广泛应用[10]。目前，琼胶改性研究主要集中在对琼胶进行降解制备琼胶寡糖方面，但实际得到有效应用和产品开发方面还基本处于空白，其他有关琼胶改性的研究也相对较少[11]。

针对市场对琼胶改性技术和不同应用特性产品的需求，本文借鉴成熟的淀粉改性技术 (羧甲基化、氧化和羟丙基化) 对天然琼胶进行改性研究，比较分析了3种改性方法对琼胶理化性质、凝胶特性、结构特征和热稳定性的影响，以期为建立琼胶改性新技术提供理论支撑，并为开发不同应用特性的琼胶新产品提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

琼胶粉由汕头市澄海区琼胶厂提供；氯乙酸(北京百灵威科技有限公司)；30%过氧化氢、环氧丙烷、氢氧化钠、无水乙醇等 (广州化学试剂厂)，试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV2550紫外可见光光度计 (日本岛津公司)；IRAffinity-1红外光谱仪 (日本岛津公司)；CR-400色差仪 (日本Konica Minolta公司)；HH-4快速恒温数显水浴锅 (常州澳华仪器有限公司)；CT 3质构仪 (美国Brookfield公司)；BS224S分析天平(美国Sartorius公司)；DSC100差示扫描量热仪(南京大展机电研究所)；其他均为实验室常用仪器设备。

1.3 方法

1.3.1 改性琼胶制备方法 1) 羧甲基琼胶。参考别蒙等[12]的方法，略作修改。称取5 g琼胶粉分散至50 mL、80% (体积分数，下同) 的乙醇溶液中，40 ℃下搅拌溶胀0.5 h，加入0.5 g氢氧化钠 (NaOH)，继续搅拌碱化反应2 h后，再向锥形瓶中加入1.16 g氯乙酸 (ClCH2COOH)，同时补充0.5 g NaOH。最终 n(琼胶)∶n(ClCH2COOH)∶n(NaOH) 的摩尔比为1∶1.5∶0.75。封口后，在55 ℃下磁力搅拌5 h后结束反应。自然冷却至常温，用1 mol·L−1冰醋酸 (CH3COOH) 溶液将体系调pH 至7.0，再用真空抽滤收集滤饼，滤饼用60%乙醇洗涤、抽滤，反复操作至滤液中无氯离子 (Cl−) 检出，所得滤饼在60 ℃烘干，粉碎、过80目筛，得到羧甲基琼胶(Carboxymethyl agar, CMA)。

2) 氧化琼胶。参考Xiao等[13]的方法，略作修改。称取25 g琼胶粉分散至250 mL 45%乙醇溶液中，用1 mol·L−1NaOH溶液调pH至9.0，然后缓慢滴加11 mL 30%过氧化氢 (H2O2) 溶液，30 ℃保温反应3 h，然后用1 mol·L−1冰醋酸溶液调pH至7.0，真空抽滤收集滤饼，滤饼用60%乙醇溶液洗涤、抽滤，反复操作3次，最后将滤饼在60 ℃烘干，粉碎、过80目筛，得到氧化琼胶 (Oxidized agar, OA)。

3) 羟丙基琼胶。参考Zhang等[14]的方法，略作修改。称取30 g琼胶粉于锥形瓶中，加入210 mL去离子水和1 g无水硫酸钠 (Na2SO4)，搅拌使其分散均匀，加入0.3 g NaOH，在恒温水浴锅中升温至45 ℃，逐滴滴加30 mL的环氧丙烷 (C3H6O)，密封反应12 h。反应结束后，用1 mol·L−1的冰醋酸溶液将反应液pH调至7.0，真空抽滤收集滤饼，滤饼再用60%的乙醇溶液洗涤、抽滤，反复操作3次，最后在60 ℃烘干，粉碎、过80目筛，得到羟丙基琼胶 (Hydroxypropyl agar, HPA)。

1.3.2 琼胶物理性质测定[15]1) 溶解温度测定。配制质量分数为1.5%的琼胶溶液混合均匀后，置于50 ℃恒温水浴锅中，逐渐升温，升温速率为1 ℃·min−1，记录琼胶完全溶解时的温度，即为琼胶的溶解温度。

2) 凝胶温度测定。将步骤1) 溶解后的琼胶溶液倒入25 mL试管至2/3，用带温度计的试管塞封住试管口 (温度计水银球浸入液面以下)，将试管放置在试管架自然冷却凝胶，当倾斜试管时，凝胶刚好不流动时的温度，即为琼胶的凝胶温度。

3) 凝胶再溶温度测定。将步骤2) 凝胶的试管于4 ℃冰箱静置4 h，然后在凝胶表面放置1粒直径为5 mm的玻璃珠，同样置于水浴锅内以1 ℃·min−1的升温速率加热，记录玻璃珠下降到试管底部时的温度，即为琼胶凝胶的再溶温度。

4) 琼胶凝胶强度测定。参照《GB 1975—2010食品安全国家标准 食品添加剂琼脂 (琼胶)》附录A.5中规定的方法制备琼胶凝胶，凝胶在20 ℃条件下恒温24 h，采用质构仪测定凝胶强度，测定探头为1 cm2圆柱形探头，测试速度为1.0 mm·s−1。

1.3.3 琼胶色泽测定 琼胶的颜色采用CR-400色彩色差仪在D65光源下测定，结果用CIE [ 亮度 (L*)，红绿值 (a*)，黄蓝值 (b*)] 表示，并通过亨特白度指数(WH)进行比较，WH值越大，表示白度越高[16]。

1.3.4 凝胶透明度测定 参考杜建华等[17]的方法，略做修改。配制质量分数为1.5%的琼胶溶解液，趁热转移至1 cm具塞比色皿中，室温放置过夜后，在波长700 nm处测定样品透过率 (Transmittance, T)。

1.3.5 凝胶质构特性测定 用CT3质构仪测定。将质量分数为1.5%的琼胶凝胶切割成直径为1.5 cm、高1.5 cm的圆柱形小块，置于样品台上，选择TPA模式，选择T11圆柱探头，测试速度1.0 mm·s−1，触发点载荷5 g，压缩比30%，记录琼胶凝胶的硬度、内聚性、弹性和咀嚼性[18]，测定3次取平均值。

1.3.6 凝胶析水率测定 参考李晓艺等[19]的方法，略作修改。将1.5%琼胶凝胶切割成规则的2 cm×2 cm×2 cm立方体，置于带盖离心管中，称质量，分别在−18 ℃、−3 ℃、4 ℃和25 ℃下放置 24 h，解冻后以 6 000 r·min−1的转速离心10 min，用滤纸吸去凝胶表面水分，再次称质量。析水率(%)按下式计算：

式中m1为凝胶初始质量 (g)；m2为离心后凝胶质量 (g)。

1.3.7 傅里叶红外光谱 (Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR) 测定 采用FT-IR方法对琼胶的化学结构进行定性分析。为了避免水分干扰，溴化钾 (KBr) 在105 ℃干燥10 h，在红外灯下与琼胶混合研磨成粉，压片后在4 000～400 cm−1的波长范围内测量。并用OMNIC 8.2软件进行数据分析。

1.3.8 琼胶热稳定性测定 参考《GB/T 22232—2008 化学物质的热稳定性测定 差示扫描量热法》规定的方法。加热范围为25～300 ℃，升温速率为15 ℃·min−1，气氛为氮气，得到样品的差示扫描量热法 (DSC) 曲线。

1.3.9 数据处理 采用SPSS 21.0软件对试验数据进行统计分析，每组试验做3次平行，结果用“平均值±标准差 (X ±SD)”表示，用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同改性方法对琼胶物理性质的影响

羧甲基化和羟丙基化改性可显著降低琼胶的溶解温度、凝胶温度、凝胶再溶温度和琼胶强度(P＜0.05)，氧化改性法可显著降低琼胶的溶解温度、凝胶再溶温度 (P＜0.05)，对琼胶的凝胶温度无显著影响 (P＞0.05)，对琼胶强度有显著增强作用(P＜0.05)。其中羧甲基化对4项指标降低最为明显，羟丙基化次之，氧化法最弱 (表1)。改性琼胶物理指标下降的原因是由于NaOH或氧化剂的存在使琼胶发生不同程度的降解、分子量降低；另外改性后的琼胶分子上引入羧甲基或羟丙基基团，这些基团的亲水性使得琼胶更易溶胀，尤其是受热时琼胶分子链得到不同程度的伸展，而基团间的相互排斥作用阻碍了琼胶双螺旋体聚集、抑制了凝胶形成，使得琼胶的凝胶温度和凝胶强度降低。此外，琼胶分子结构的改变也抑制了琼胶分子三维网状结构的形成或使网状结构更为疏散，水分子更容易进入网状结构，凝胶在形态转化时需要的能量也更低，因此琼胶的溶解温度和凝胶再溶温度降低[20]。氧化琼胶凝胶强度高达1 463 g·cm−2，较原琼胶提高了48.7%。氧化琼胶凝胶强度提高的主要原因是H2O2处理后硫酸盐含量的减少和乙醇洗涤过程中去除了部分杂质[21]。

表1 改性对琼胶物理性质的影响Table 1 Effects of modifications on physical properties of agar

2.2 不同改性方法对琼胶色泽和凝胶透明度的影响

琼胶作为常用的食品添加剂，在其发挥作用的同时应尽量不改变食品原有的色泽[22]，因此琼胶的色泽和凝胶透明度是琼胶品质的重要指标。由表2可知，经过改性处理，羧甲基琼胶的L*显著降低(P＜0.05)，氧化琼胶和羟丙基琼胶L*显著提高(P＜0.05)；羧甲基琼胶的a*和b*显著升高 (P＜0.05)，说明其颜色呈现偏黄的趋势，而氧化琼胶和羟丙基琼胶的a*和b*显著降低 (P＜0.05)，表明其颜色偏绿；氧化琼胶和羟丙基化琼胶的WH显著增大(P＜0.05)，羧甲基化琼胶白度WH显著减小 (P＜0.05)。琼胶白度提高可能是因为改性过程中乙醇洗涤在去除试剂残留的同时，也使叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素等有色物质溶出[23]，羧甲基琼胶白度降低 (感官颜色偏黄) 可能由反应体系强碱环境所致[24]；透过率 (T) 的大小反映凝胶是否透明，T越大，凝胶越透明。羧甲基化、氧化和羟丙基化琼胶的T较原琼胶显著提高 (P＜0.05)，分别为82.21%、55.70%和68.60%，是原琼胶 (23.93%) 的3.4、2.3和2.9倍。琼胶凝胶透明度直接反映琼胶分子与水分子的亲和力，琼胶改性引入的负电荷基团相互排斥，使得分子链间距增大，分子易舒展，水分子快速填充，光线发生透射程度高，反射程度低，因此改性琼胶表现出良好的透明度[25]。

表2 改性对琼胶色泽和凝胶透明度的影响Table 2 Effects of modifications on color and gel transparency of agar

2.3 不同改性方法对琼胶凝胶质构特性的影响

采用质地多面剖析法 (Textural profile analysis,TPA) 对琼胶进行质构分析，测定琼胶凝胶硬度、内聚性、弹性及咀嚼性表征其质构性能。由表3可见，与原琼胶相比，羧甲基和羟丙基化琼胶凝胶弹性和内聚性显著提高 (P＜0.05)，尤其是羧甲基化琼胶最明显，但凝胶的硬度和咀嚼性均显著降低(P＜0.05)，表明羧甲基和羟丙基化后，琼胶变得软弹，抵抗外力作用的能力减弱，恢复原有形状的能力增强，凝胶柔韧性增强。这可能是由于带电基团的相互斥力导致形成的凝胶结构较松散[26]。氧化琼胶的质构特性与原琼胶相比无显著变化 (P＞0.05)。通过改性可以得到不同质构特性的琼胶，可为食品行业提供更多的选择。

表3 改性对琼胶凝胶质构的影响Table 3 Effects of modifications on gel texture properties of agar

2.4 不同改性方法对琼胶凝胶析水率的影响

琼胶持水能力的高低取决于其凝胶的析水率，析水率越低，琼胶的持水能力越强。凝胶在不同温度下的持水性反映了琼胶凝胶对温度变化的稳定性。4种琼胶在−18 ℃析水率最高，−3 ℃析水率最低 (图1)，说明适当低温有利于琼胶凝胶保持较好的持水能力。在−18 ℃冷冻环境下，氧化琼胶的析水率高于原琼胶，而羧甲基化和羟丙基化后琼胶的析水率大幅降低，说明羧甲基琼胶和羟丙基琼胶具有较好的冻融稳定性。这种现象可能是由于氧化琼胶中硫酸基含量相对较低，在凝胶形成过程中，形成的双螺旋结构也较长，表现为凝胶强度提高，但这种结构在低温下也容易被破坏，使结合的水分子析出[27]，因此析水率提高。相反，对于羧甲基化和羟丙基化琼胶，因适量降解和带电基团的引入，形成的凝胶呈较短的双螺旋结构，移动性好，结合水分子的能力增强，导致析水率减弱；另外经羧甲基化和羟丙基化后，琼胶分子上的羟基被取代而减少，导致琼胶分子间氢键的形成变得困难，并且引入基团间的排斥作用使琼胶分子的空间位阻变大，使琼胶能够保持较好的持水能力[28]，导致析水率降低，表现出较好的冻融稳定性。原琼胶的析水率较高，可能由于其分子上的羟基在凝胶状态下易形成氢键，这种氢键对琼胶凝胶结合的水分子具有排挤作用。4种琼胶中羧甲基化琼胶在不同温度下均表现出最低的析水率，表明羧甲基化能够更有效地提高琼胶凝胶的持水能力，这可能与羧甲基的亲水性有关。

图1 不同温度下的析水率差异Figure 1 Difference of syneresis rate at different temperatures

2.5 傅里叶变换红外光谱

原琼胶的红外光谱显示在3 700～3 000 cm−1处出现较宽的伸缩振动峰，是琼胶上−OH分子内和分子间氢键拉伸的结果（图2）；在约2 900 cm−1出现吸收峰属于C−H的对称伸缩振动特征峰，是典型的多糖特征吸收峰[29]；1 640 cm−1处出现C＝O键的伸缩振动吸收峰；1 250 cm−1处存在一较弱峰，由O＝S＝O不对称伸缩振动引起，表明琼胶中存在着少量的硫酸基；1 070 cm−1处为内醚环上C−O−C醚键的伸缩振动；在921 cm−1和865 cm−1处的吸收峰是由于吡喃环上的−CH2伸缩振动引起的[30]。琼胶经过改性后在3 700～3 000 cm−1处的吸收峰变弱，说明琼胶分子上的羟基含量减少，这是−OH被取代的结果。改性后的琼胶在1 150 cm−1和1 070 cm−1与原琼胶有不同的吸收峰，这些峰和琼胶骨架有关，表明改性处理的琼胶空间结构发生了变化。在羧甲基琼胶的FT-IR图谱中，1 600 cm−1出现羧酸盐−COO−的不对称伸缩振动吸收峰，1 420 cm−1附近出现次甲基−CH伸缩振动弱吸收峰，表明羧甲基被成功地引入琼胶分子中[31]。氧化琼胶与原琼胶的红外光谱没有明显变化，氧化琼胶在1 439 cm−1处的吸收峰略强于原琼胶，说明琼胶经H2O2处理后，发生氧化的程度较低。琼胶经羟丙基化后在1 439 cm−1出现C−O单键的伸缩振动吸收峰，可能由羟丙基与琼胶上的活性羟基缔合引起的，证明羟丙基被一定程度地加到了琼胶分子骨架上。

图2 琼胶改性前后的FT-IR光谱对比Figure 2 Comparison of FT-IR spectra before and after modification of agar

2.6 不同改性方法对琼胶热稳定性的影响

改性处理不同程度地影响着琼胶的热稳定性，原琼胶在约265 ℃出现琼胶晶区熔融吸热峰，起始温度245 ℃，结束温度290 ℃。羧甲基改性后，该吸热峰出现在258 ℃处，熔融起始温度230 ℃，结束温度270 ℃，整体向左偏移 (图3)，说明羧甲基化降低了琼胶的热稳定性。这可能是由于羧甲基的引入，致使琼胶分子间和分子内氢键被破坏，作用力减弱，破坏了其原有的致密结构。此外，羧甲基化过程中的强碱环境使得琼胶分子链长度变短，热稳定性降低[32]。相反，经过氧化和羟丙基化改性后，在约280 ℃出现琼胶的熔融吸热峰，在260 ℃开始熔融，结束温度290 ℃，氧化和羟丙基化处理提高了琼胶热稳定性。原因可能是氧化过程中H2O2的脱硫酸盐作用和羟丙基化过程引入的羟丙基团产生的空间位阻作用保护了苷键在高温下断裂。决定琼胶热稳定性强弱的本质因素是琼胶本身的结构[33-34]。当引入不同的基团，琼胶的热稳定性也随之改变。

图3 琼胶改性前后的差示扫描量热法对比Figure 3 Comparison of DSC before and after modification of agar

3 结论

本文比较了3种化学改性方法对天然琼胶性质的影响。结果表明，3种改性方法对琼胶的理化性质、色泽、凝胶透明度、凝胶质构特性和热稳定性均有不同程度的改变。通过比较可以得出，羧甲基化后，琼胶白度和热稳定性降低，可溶于约65 ℃的热水，冷却形成的凝胶质地较为软弹，透明度大幅提高，同时表现出优秀的持水能力。羧甲基改性对琼胶的理化性质影响最大，宜作为制备低溶点速溶软凝胶的方法。和天然琼胶相比，氧化琼胶在−18 ℃时的冻融稳定性稍差，但其他理化性质均优于天然琼胶，尤其是凝胶强度增加了48.7%。因此在适当的温度和pH下，过氧化氢处理是一种改良琼胶整体品质的有效手段。羟丙基化后，琼胶的白度、热稳定性和溶解性能得到改善，制得的凝胶更透明，持水能力更强，但凝胶强度会随着改性的程度增大而降低。琼胶IR分析显示，改性琼胶均保持琼胶的基本结构，氧化琼胶只发生轻微氧化作用，羧甲基化和羟丙基化琼胶发生了羟基取代反应。总体而言，本文的3种改性方法可制备出不同应用特性的琼胶，有望在食品、生物和医药等领域发挥特定的作用，也为进一步深入研究琼胶的改性机制及应用提供了理论基础。