盐度骤变对金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞形态结构的影响

余焱方 ，刘鉴毅 , ，冯广朋 , ，赵 峰 , ，孙雪娜 ，王 妤, ，邹 雄, ，黄晓荣 , ，李 琪 ，孙艳秋 ，郑文明

（1. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306； 2. 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090； 3. 农业农村部东海与长江口渔业资源环境科学观测实验站，上海 200090）

水环境盐度的急剧变化会引起鱼体内环境失衡，不仅会造成组织器官损坏、渗透条件功能丧失，还会影响其存活和生长[1-2]。广盐性硬骨鱼类通过调节鳃丝上皮中氯细胞的数量、分布等来适应外界水环境的盐度变化，氯细胞在鱼类渗透压调节中起到重要的作用。研究表明，氯细胞不仅可以在高渗条件下分泌和吸收钠离子 (Na+)、钾离子 (K+)，还可在低渗条件下向外界分泌氯离子 (Cl−)，具有离子的双向转运功能[3-4]。在不同盐度海水环境下鳃氯细胞主要发挥离子吸收和离子分泌的作用，其数量和形态大小会因外界盐度变化而发生相应改变[5]。为了适应外界环境盐度骤变，鳃氯细胞发生形态结构的相应改变，不同亚型之间通过可逆性的转变进行渗透调节，以维持内外环境稳定[6]。

金钱鱼 (Scatophagus argus)，也称金鼓鱼，属于鲈形目，广泛分布于印度-太平洋水域，属于广盐性亚热带硬骨鱼类，在渗透调节方面具有很强的适应性[7]。目前有关金钱鱼渗透调节方面的研究报道主要涉及盐度相关基因的克隆与表达[8]、渗透基因的表达分析[9-10]、抗氧化作用的相关研究[11]，而盐度对金钱鱼组织学的影响研究较少。本实验采用普通光学显微镜和透射电子显微镜，观察金钱鱼幼鱼在盐度骤变后的不同时间内，鳃线粒体丰富细胞(Mitochondria-rich cells, MRCs)的形态结构变化，比较分析鳃线粒体丰富细胞在盐度适应过程中的变化规律，为阐明鱼类鳃的结构特征与其盐度适应调节关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验于中国水产科学研究院东海水产研究所福鼎基地进行，选择人工繁殖后健康的金钱鱼幼体，体长为 (4.68±0.09) cm，体质量为 (6.31±0.25) g，暂养于基地水槽中，周期30 d。

1.2 实验设计与样品采集

实验暂养期间，以当地自然海水盐度为对照组(20 盐度组)，温度为 (22±0.5) ℃，pH 7.8～8.1，溶解氧质量浓度大于6.5 mg·dm−3，氨氮质量浓度(0.10±0.02) mg·L−1。24 h 连续充气，每天换水1/3，并于早晚各喂食1次，投喂饲料为鱼体质量的1%，喂食1 h 后吸污。实验以20盐度组为对照组，暂养1周后直接投入5盐度组和35盐度组的水体中，每组设3个平行，每个平行30尾鱼，饲养于2个直径80 cm、高72 cm的塑料水槽中。实验开始后于第3、第6、第12、第24、第48和第96小时分别取样，对照组于实验结束时取样。从各水槽内随机选取3尾幼鱼，取左侧第二鳃弓鳃丝，取样期间不喂食，实验期间无死亡。

光镜样品用波恩溶液保存，固定24 h，经流水冲洗，在Lecia TP 1 020脱水机下进行乙醇梯度脱水 (脱水梯度0%、80%、95%、100%)，石蜡包埋，Lecia RM 2 135切片机超薄切片，厚度为4～5 μm。苏木精-伊红进行染色，中性树胶封片，Axio Scope·A1型光学显微镜观察并拍照。电镜样品用戊二醛固定，4 ℃下固定1周，0.1 mol·L−1的PBS室温冲洗3次，1%锇酸溶液固定l h，进行梯度乙醇脱水 (30%、50%、70%、80%、90%、100%)，分离鳃弓中部的鳃丝，Epon 812渗透和包埋，ULTRACUTE超薄切片机切片，采用醋酸铀-柠檬酸铅双染的常规电镜切片染色，日立 (JSM 5 610)透射电镜观察、拍照。

1.3 实验数据测量与统计分析

将光学显微镜拍照所得照片用Imager proplus 6.0软件经校准后，对金钱鱼鳃线粒体丰富细胞长径与短径、次级鳃小片直径进行测量 (用GL 表示)随机选取测量6组数据，然后取平均值。

2 结果

2.1 盐度骤变金钱鱼幼鱼鳃的显微结构变化

切片经HE染色后，各种细胞的细胞质呈浅红色，细胞核呈蓝色 (图1、图2)。低盐胁迫第3小时其线粒体丰富细胞长径 [(9.517±1.390) μm]和短径 [(7.150±1.448) μm]显著大于对照组长径 [(7.317±0.986) μm]和短径 [(5.067±0.467) μm] (P＜0.05)，胁迫24 h后线粒体丰富细胞长径和短径与对照组均存在显著差异 (P＜0.05)。胁迫第3小时次级鳃小片直径[(12.783±1.603) μm]较对照组 [(10.567±1.217) μm]差异显著(P＜0.05)，6 h后鳃小片直径均小于对照组。

图1 5盐度组胁迫金钱鱼鳃的显微结构图a. 5盐度组3 h鳃丝整体图；b. 5盐度组3 h鳃丝部分放大图；c. 5盐度组6 h鳃丝部分放大图；d. 5盐度组12 h鳃丝部分放大图；e. 5盐度组24 h鳃丝部分放大图；f. 对照组 (20盐度) 鳃丝； g. 5盐度组96 h鳃丝部分放大图；MRCs. 线粒体丰富细胞；MC. 黏液细胞；BC. 血细胞；GL. 表示次级鳃小片直径；pl. 初级鳃小片；sl. 次级鳃小片；ecm. 在细胞外软骨质中；后图同此Figure 1 Microscopic structure of S. argus gills at salinity of 5a. Whole picture of gill filament at salinity of 5 and at 3rd hour; b. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 3rd hour ; c. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 6th hour; d. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 12th hour; e. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 24th hour; f. Gill filament at salinity of 20 (Control group); g. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 96th hour;MRCs. Mitochondrion-rich cells; MC. Mucus cell; BC. Blood cell; GL. Secondary gill lamella diameter; pl. Primary gill lamella;sl. Secondary gill lamella; ecm. In extracellular cartilaginous bone. The same below.

图2 35盐度组胁迫金钱鱼鳃的显微结构图a. 35盐度组3 h鳃丝部分放大图；b. 35盐度组6 h鳃丝部分放大图；c. 35盐度组12 h鳃丝部分放大图；d. 35盐度组24 h鳃丝部分放大图；e. 35盐度组96 h鳃丝部分放大图；f. 对照组 (20盐度) 鳃丝部分放大图Figure 2 Microscopic structure of S. argus gills at salinity of 35a. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 3rd hour; b. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 6th hour; c. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 12th hour; d. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 24th hour; e. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 96th hour; f. Control group, enlarged view of gill filament at salinity of 20

高盐胁迫第3小时次级鳃小片直径 [(21.333±2.510) μm]显著大于对照组 [(10.567±1.217) μm] (P＜0.05)，第12小时金钱鱼鳃的线粒体丰富细胞长径[(6.267±0.723) μm]和短径 [(3.850±0.638) μm]显著小于对照组长径 [(7.317±0.986) μm]和短径 [(5.067±0.467) μm] (P＜0.05)，第 24和第 48小时与对照组差异不显著，第96小时短径 [(5.967±0.588) μm]与对照组短径 [(5.067±0.467) μm]差异较显著 (P＜0.05，表 1，表 2)。

表1 不同盐度下金钱鱼鳃线粒体丰富细胞长径、短径变化Table 1 Changes of long and short diameters of MRCs in S. argus gill at different salinities

表2 不同盐度下金钱鱼次级鳃小片直径的变化Table 2 Changes in diameter of secondary gill lamella of of S. argus at different salinities

2.1.1 5盐度组急性胁迫下金钱鱼幼鱼鳃的显微结构变化 胁迫第3小时初级鳃小片基部、次级鳃小片上均分布有线粒体丰富细胞，但主要存在于次级鳃小片上。鳃丝部分膨大，次级鳃小片增生。黏液细胞主要在初级鳃小片基部，数量较少，细胞外软骨质中间隔增大 (图1-a、1-b)。第6小时线粒体丰富细胞数量明显增加，初级鳃小片基部膨大，次级鳃小片直径缩短 (图1-c)。第12小时线粒体丰富细胞数量减少，血细胞数量增加，并向次级鳃小片顶端蔓延 (图1-d)。第24小时线粒体丰富细胞数量变化差异不大，从次级鳃小片基部往顶端延伸，顶端线粒体丰富细胞数量的增加使得次级鳃小片呈膨胀状态，但鳃丝可见整体形状，处于主动调节阶段(图1-e)。第96小时鳃丝发生显著变化，呈细长状，线粒体丰富细胞主要分布在初级鳃小片上，与对照组 (图1-f) 形态差异不大，此时经过主动调节后开始适应外界环境，达到新的平衡 (图1-g)。

2.1.2 35盐度组急性胁迫下金钱鱼幼鱼鳃的显微结构变化 第3小时鳃丝着色较浅，次级鳃小片增生，鳃丝整体形状呈溶解状，细胞出现脱落、坏死，线粒体丰富细胞数量较少 (图2-a)。第6小时线粒体丰富细胞数量增加，主要分布在次级鳃小片基部，软骨细胞数量增加，黏液细胞主要分布在初级鳃小片上 (图2-b)。第12小时线粒体丰富细胞主要分布在初级鳃小片上，数量显著减少，血细胞数量增加，存在于细胞外软骨质中，排列分布在初级鳃小片上，并向次级鳃小片顶端蔓延。鳃小片形态完整，此时最接近对照组 (图2-c、2-f)。第24小时鳃丝整体着色加深，线粒体丰富细胞主要分布在次级鳃小片基部，数量增加 (图2-d)。第96小时细胞着色显著加深，线粒体丰富细胞显著增加，主要分布在次级鳃小片上，黏液细胞紧密分布在初级鳃小片上，鳃丝形态与对照组相似 (图2-e、2-f)。

2.2 盐度骤变金钱鱼幼鱼鳃的透射电镜观察结果

透射电镜下金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞一般为圆形或椭圆形，根据不同盐度下线粒体丰富细胞内部结构不同，且顶端开口方式多样，故分为：1) Ⅰ型线粒体丰富细胞，细胞的体积较大，一般为椭圆形，胞核形状不规则，内脊发达，顶端开口处于关闭或开放状态；2) Ⅱ型线粒体丰富细胞，细胞数量较多，大多为圆形，胞核规则呈圆形，具有多个顶端开口。细胞内存在大量线粒体以及丰富的网管系统，微细小管系统相互交错形成大小不一的珠泡状结构。线粒体形态多样，包括弯曲形、圆形和椭圆形，主要有2种形态：1) a型线粒体，形状粗短，着色较浅；2) b型线粒体，着色较深，呈小的颗粒状。

2.2.1 5盐度组急性胁迫下金钱鱼幼鱼鳃的透射电镜观察结果 低盐胁迫下金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞呈2种形态，第3小时观察发现为Ⅰ型线粒体丰富细胞，顶端开口处于关闭状态或形成顶隐小窝 (图3-b、3-e、3-f)。胞质内具有大量的线粒体，示a型线粒体。第6小时可观察到线粒体丰富细胞周围具有发达的网管结构，与周围辅助细胞形成紧密连接，细胞内线粒体数量较多 (图3-c)。第12小时线粒体丰富细胞具有顶端开口，向内凹陷形成顶隐小窝，有光泡结构(图3-d)。第24小时细胞内的线粒体数量较少，呈散状分布，多为粗短形，细胞之间连接紧密 (图3-e)。第48小时出现细胞核色素沉积反应，透射电镜下观察到大部分线粒体丰富细胞的细胞核发生色素沉积 (图3-f)。第96小时为Ⅱ型线粒体丰富细胞，细胞之间紧密连接，胞核形状多为圆形，细胞内线粒体数量较少，为b型线粒体，细胞开放直接与外界相接触，胞内具有形状大小不一的珠泡结构，具发达的微细小管系统(图3-g)。20盐度组 (对照组)，线粒体丰富细胞一般呈圆形，胞核体积较大，形状规则，胞质内具有大量的线粒体，主要为a型线粒体，胞质间可见光泡结构 (图 3-i)。

图3 5盐度组胁迫对金钱鱼鳃超微结构的影响a. 5盐度组3 h后鳃小片的超微结构； b. 5盐度组3 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图，示Ⅰ型线粒体丰富细胞；c. 5盐度组6 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图；d. 5盐度组12 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图；e. 5盐度组24 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图；f. 5盐度组48 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图；g. 5盐度组96 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图，示Ⅱ型线粒体丰富细胞结构；Ao. 顶端开口；Ap. 顶端小窝；MRCs. 线粒体丰富细胞；M. 线粒体；M1. a型线粒体；M2. b型线粒体；N. 细胞核；tn. 管网结构；lv. 光泡；JC. 紧密连接；N1. 形成色素的细胞核；h. 示a型线粒体；i. 对照组(20盐度组) 鳃超微结构整体图；Ts. 微细小管系统；后图同此Figure 3 Effects of salinity 5 stress on ultrastructure of gill of S. argusa. Ultrastructure structure of gill lamella at salinity of 5 and at 3rd hour; b. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 3rd hour, showing Type I mitochondrionrich cells; c. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and a 6th hour; d. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 12th hour; e. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 24th hour; f. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 48th hour; g. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 96th hour, showing Type II mitochondrion-rich cells; Ao. Apical opening; Ap. Apical crypt; MRCs. Mitochondrion-rich cells;M1. Type a Mitochondrion; M2. Type b mitochondrion; N. Nucleus; tn. Tubular network; lv. Light vesicles; JC. Junctional complex;N1. Chromogenic nucleus; h. Showing Type a mitochondrion; i. Control group (salinity of 20),whole picture of gill ultrastructure; Ts. Microtubule system; the same below.

2.2.2 35盐度组急性胁迫下金钱鱼幼鱼鳃的透射电镜观察结果 高盐环境下线粒体丰富细胞体积膨大，呈分散溶解状态，示Ⅱ型线粒体丰富细胞，与5盐度组相比，细胞内线粒体数量显著增多，胞核形状较规则，多为圆形，具有顶端开口，顶膜内凹形成顶隐小窝，凹陷程度较5盐度组深，且细胞之间多相邻分布 (图4-d)，顶膜表面具有大量微绒毛 (图4-f)。第3小时线粒体丰富细胞分布不紧密，且细胞为开放状态直接与外界相接触，细胞内的线粒体数量较少，a型线粒体和b型线粒体数量较均匀，细胞中孔洞结构较多，微细小管系统发达(图4-b)。第6小时可观察到明显的微脊结构 (图4-c)。第12小时可观察到顶隐小窝，且开口较深 (图4-d)。第24小时线粒体丰富细胞没有明显的边界，其细胞核出现色素沉积，胞核形状开始改变，变成椭圆形 (图4-e)。第48小时胞核明显变小且出现色素沉积反应，顶膜开口处可观察到大量微绒毛 (图4-f)。第96小时线粒体丰富细胞两两相邻，2种形态的线粒体均存在且数量也明显增加 (图4-g)。

对照组即为20盐度组，线粒体丰富细胞体积大，且多相邻分布，细胞内线粒体数量较多，分布密集，微细小管系统发达，微脊结构明显 (图4-h)。细胞之间紧密连接，胞核形状较为规则，多为卵圆形 (图 4-i)。

3 讨论

鳃上皮主要包括鳃丝上皮和鳃小片上皮，鳃与外界环境进行气体交换主要在鳃小片上皮进行[12]。鱼类鳃上的线粒体丰富细胞大约只占鳃部细胞比例的8%左右，却在渗透调节过程中发挥重要作用[13-15]。鱼鳃内的线粒体丰富细胞在外界水环境盐度发生变化时，主要通过细胞结构、形态和功能的变化，以及各亚型之间发生可逆性转变的结构修改来适应外界环境渗透压变化，以维持自身的生存[8]。

3.1 盐度骤变鳃的显微结构

本实验将自然海水中驯养的金钱鱼幼鱼直接投入5盐度组胁迫3 h，线粒体丰富细胞长径和短径显著大于对照组，此时，线粒体丰富细胞体积增大，6 h后线粒体丰富细胞数量才显著增加，鳃小片发生膨胀、增生，以及部分细胞脱落[16]，原因可能是外界环境渗透压低于鱼体内渗透压，通过线粒体丰富细胞体积的变化来适应外界的盐度变化，鱼体也可能通过增加排尿量排出体内多余的水分保持盐分[17]。吴勇等[18]将细鳞鱼刺 (Terapon jarbua) 幼鱼投入盐度5条件下，经24 h的自身渗透压调节后，其含水量基本恢复至原状即渗透压恢复平衡，本研究5盐度组24 h后鳃丝形态较完整，此时可能处于渗透调节的主动修复阶段。第96小时鳃丝与对照组差异不大，但是次级鳃小片明显变长、变细，说明金钱鱼幼鱼通过鳃丝变长、变细，增大与水体的接触面积，从而主动向水体中释放离子，以此适应低盐环境。

高盐胁迫3 h次级鳃小片直径显著增大，且鳃小片出现膨胀、增生、部分细胞脱落的现象，这与咸海卡拉白鱼 (Chalcalburnus chalcoides aralensis)[19]和大鳞鲃 (Barbus capito)[20]的研究结果相似。6 h后线粒体丰富细胞数量显著增加，说明高渗环境下，金钱鱼幼鱼主要通过增加线粒体丰富细胞的面积和密度来适应外界环境的盐度变化[21]。李佳佳[22]将暗纹东方鲀 (Takifugu obscurus) 对于盐度变化的适应过程主要分为3个阶段：1) 反应阶段，盐度突变初期，随着盐度升高，暗纹东方鲀吞饮海水，血浆渗透压迅速上升，刺激鱼机体渗透调节生理机制发生改变；2) 主动调节阶段，幼鱼逐渐适应盐度突变后开始进行主动调节，伴随着鳃丝和肾脏酶活性的升高，血浆离子和渗透压开始回落；3) 适应阶段，经过对盐度突变的反应和主动调节过程，幼鱼开始适应外界环境，其内环境稳态逐渐趋向新的平衡。本实验在盐度突变24 h内观察比较对照组鳃丝变化，判断此阶段是金钱鱼幼鱼对外界环境反应后开始主动调节阶段，而后期在进行了一系列调节反应后，开始适应并趋向新的平衡。

3.2 盐度骤变鳃的超微结构

进入低盐环境后，为适应环境突变，分化出Ⅰ型线粒体丰富细胞、a型线粒体，可能是为了增大与外界环境的反应面积，从而吸收水中的离子以维持内外渗透压平衡，为离子吸收型线粒体丰富细胞，但是随着时间的延长，开始慢慢适应低盐环境，线粒体丰富细胞发生结构变化，分化出Ⅱ型线粒体丰富细胞、b型线粒体，有利于向外界分泌离子，为离子分泌型线粒体丰富细胞。此时，经过适应阶段后，主要是由离子分泌型线粒体丰富细胞维持内外渗透压平衡。

吴贝贝[23]应用透射电镜观察发现，高渗环境下，鱼鳃的线粒体丰富细胞顶膜凹陷形成顶隐窝，细胞数量增加。本实验在高盐环境下由透射电镜观察发现线粒体丰富细胞具有顶端开口，且开口较深，内凹形成顶隐小窝，细胞数量显著增加，顶膜与外界环境接触，促进离子分泌来适应外界盐度的改变[24-29]。高盐环境下线粒体丰富细胞体积增大，细胞见溶解状态[30]。但在高盐环境下主要是Ⅱ型线粒体丰富细胞，细胞内的线粒体数量较多，称a型线粒体和b型线粒体，但主要是b型线粒体，可能由于在急性高渗胁迫环境下，鱼体急需向外界分泌离子，从而增加了细胞与外界的接触面积，通过线粒体形态的改变，促进离子分泌。随着时间延长，经过适应反应后，2种线粒体形态细胞共同存在以维持内外渗透压平衡，这可能与金钱鱼本身生存的自然海水环境相关。

4 小结

显微结果表明盐度骤变24 h金钱鱼幼鱼鳃处于主动调节阶段，透射电镜结果表明盐度骤变金钱鱼幼鱼能分化出海水和淡水2种适应性线粒体丰富细胞。不管盐度骤升还是骤降，金钱鱼幼鱼均会产生应答反应机制，通过鳃上线粒体丰富细胞体积、数量、形状结构的变化，以及细胞内线粒体形态结构的变化进行适应性调节，不仅在渗透调节中发挥重要作用，维持自身的生存，也很好地说明了金钱鱼是一种广盐性鱼类，具有很强的耐盐性。