响应面法优化棕色棉纤维原花青素的提取工艺

谢勇飞，赵 钢，孙 娜，吕银萍，吴 勇，沈美辰，吕文犇，高俊山

（安徽农业大学生命科学学院，合肥230036）

0 引言

棕色棉是具有棕色纤维特征的一种有色棉花，它是有色棉纺织品的重要原料之一，由于其在制成纺织品的过程中无需经过染色、还有漂白等处理，不但能减少污染，还能降低生产成本，真正做到“绿色环保”，较为符合人们重归自然的需求，因此棕色棉色素成因的研究越来越受到人们的注意[1-2]，但棕色棉纤维存在长度短、强度不高、色素不稳定等问题[3-4]，引起了学者的关注，提升棕色棉纤维质量问题亟待解决。

学者研究发现，棕色棉纤维色素的形成和和色泽的累积与色素合成相关酶基因在纤维细胞中的特异性表达相关，棕色棉纤维色素的形成主要是由于纤维中积累了黄酮类物质，棕色棉纤维发育大致需要经过纤维原始细胞的分裂突起、纤维细胞的伸长、次生壁的加厚以及脱水成熟等4个时期[5-6]，棕色棉纤维的色素主要在纤维的中腔内合成和累积[7-8]。邱新棉等[9-10]发现纤维发育的初期阶段棕色棉并没有色素的累积，色素的沉积主要在纤维发育的中后期阶段，当纤维进入细胞壁加厚期时，纤维色泽逐渐表现出淡淡的棕色，而后色泽逐渐加深。

李廷春等[11]对棕色棉色素成分进行研究表明，棕色棉纤维的色泽与原花青素相关物质的累积具有一定的关联，其认为棕色棉色素的成分有可能为原花青素及其衍生物导致的。詹少华等[12]对不同溶剂提取的色素溶液进行紫外-可见光谱检测，分析其结果得出棕色棉色素成分结构中含有酚羟基官能团，后又对棉籽种皮化学成分分析，认为种皮细胞中的缩合单宁类物质可能在转移纤维的过程中逐渐被氧化成醌类物质，而醌类物质被认为是棕色棉色素的主要成分。Ryser[13]使用薄层色谱法和细胞化学等方法，在纤维的短绒中定性到单宁类化合物的前体单元儿茶素及其衍生物，认为这些物质对棕色棉纤维的色泽呈现上起主要作用。Halloin[14]发现棉纤维是由种皮上细胞特化而来，所以原花青素很有可能与棕色棉纤维色素形成有关。Feng等[15]发现棕色棉中原花青素主要以表没食子儿茶素等没食子儿茶素为聚合单体聚合而成，与常见的原花青素有明显区别。本实验室研究认为棕色棉纤维色素主要成分是缩合单宁类物质，单宁类化合物的前体物质聚合成原花青素，氧化后形成色素成分[16]。

原花青素(Proanthocyanidin,PA)是属于缩合单宁类物质，PA具有黄烷-3-醇和黄烷-3,4二醇结构，由不同数量的没食子儿茶素，表没食子儿茶素，儿茶素，表儿茶素及其酯化产物缩合而成的聚合体，按照聚合度的大小可以分为低聚体和高聚体[17-19]，其主要存在于蓝莓、葡萄、松树皮等植物中。不同聚合度的PA在生物学活性上具有较大差异，低聚PA可以清除体内的自由基和活性氧，有极强的抗氧化能力，能预防由于人体血液中低密度脂蛋白的氧化而引起的动脉硬化、血管扩张，具有抗炎、护肤、抗氧化和抗衰老等活性功能，更有维持血管的健康和改善微循环的作用[20-22]。目前，PAs作为一种非常有效的抗氧化剂，被广泛应用于日化、保健、食品、医药等方面[23-25]，同时以其稳定性、无毒性、天然性等优点备受人们的喜爱。

目前，植物中原花青素的提取研究较为广泛和全面，有多种提取方法，如微波辅助法、双酶法等。早期提取原花青素的方法主要是溶剂提取，常用溶剂是水，原料主要来自于葡萄籽、蓝莓果渣、松树皮等[26-27]。后来随着技术的进步，提取原花青素的方法大大的优化及改进，发展出了如超声波辅助提取法、超临界CO2提取法、微波提取法、超声波微波联用等提取工艺手段[27-30]。还有根据提取物的性质不同，加入果胶纤维素酶制剂等，降解植物细胞壁，使原花青素提取物加速流出[31]。本实验通过响应面法优化超声辅助提取原花青素的方法，得到最佳的原花青素提取工艺，为原花青素的生物活性研究和产品的开发利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取生长状况良好且色泽为深棕的棕色棉品系‘棕彩选1号’(P26)，该品系被种植于安徽农业大学高新技术农业园。经前期实验室实验，筛选原花青素含量最高的花后15天的棉桃，液氮冷冻，于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 实验器材

原花青素标准品购于索莱宝生物技术有限公司，甲醇、正丁醇、盐酸试剂均为西陇科学股份有限公司分析纯试剂，-80℃超低温冰箱（合肥美菱股份有限公司），电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），光照培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），移液器（德国Eppendorf公司），高压蒸汽灭菌器购买于（日本SANYO有限公司），-20℃冰箱（合肥美的电冰箱有限公司），紫外分光光度计（上海谱元仪器有限公司），超声震荡仪（昆山超声仪器有限公司），离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 棕色棉纤维原花青素的提取及绘制标准曲线 取开花后15天的棕色棉桃，准确称取棉纤维0.1000 g样品于研钵中，液氮研磨，加入5 mL 80%甲醇，超声温度40℃，超声频率60 Hz，超声处理30 min后，5000 r/min离心15 min。分别取400 μL上清液，吸取3 mL 5%盐酸的正丁醇溶液，沸水浴20 min，迅速冰浴5 min，在550 nm可见光波长下测定吸光度，使用80%的甲醇溶液作为对照溶液，梯度配置原花青素标准曲线，400 μL加入3 mL的5%盐酸正丁醇溶液，绘制原花青素标准曲线，使用原花青素标准曲线换算原花青素含量。

1.3.2 原花青素提取率 原花青素提取率的计算见公式(1)。

式中C为原花青素提取液浓度mg/mL；V为原花青素提取试液体积100 mL；W为棉纤维鲜重g。

1.3.3 单因素实验设计 分别探讨了不同体积分数的甲醇(70%、75%、80%、85%、90%)对原花青素得率的影响，其他条件为提取温度20℃，超声频率设置为40 Hz，料液比为 1:20；不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)对原花青素得率的影响，其他条件为甲醇体积分数80%、提取温度20℃，超声频率设置为40 Hz，料液比为1:20；不同的提取时间(15 min、20 min、25 min、30 min、35 min)对原花青素得率的影响，其他提取条件为甲醇体积分数80%，提取温度20℃，超声频率为40 Hz，料液比为1:20；不同料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)对原花青素整体得率的影响，其他反应条件为提取温度20℃，超声频率设置为40 Hz，料液比为1:20。

基于单因素实验基础上，响应面优化试验设计采用Design Expert 8.0.5，Box-behnken中心组合试验设计超声时间(A)、超声温度(B)、料液比(C)和甲醇浓度(D)四因素三水平的响应面分析试验（表1），以期获得最佳的提取工艺条件。

表1 响应面法优化提取工艺的试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 原花青素标准曲线的绘制

准确称取原花青素标准品1 mg，用1 mL 80%甲醇溶解，制备标准浓度1 mg/mL的标准液，梯度稀释制备成 100、200、300、400 μg/mL浓度的标准原花青素溶液。用可见分光光度计在550 nm处依次测定吸光度值，甲醇作为对照溶液，绘制标准曲线，确定线性范围，得到线性回归方程式(2)。

式中：Y为吸光度，X为原花青素浓度，单位μg/mL。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声时间对棕色棉纤维原花青素提取率的影响取棉纤维0.10 g，加入5 mL 80%甲醇研磨，改变不同的超声时间(10～30 min)，用上述方法进行原花青素得率测定。由图1可以看出，在所选范围内原花青素的得率随超声时间的增大呈现增加趋势，超声时间在10 min到15 min之间，原花青素得率随超声时间的增大迅速增加，而在15 min到25 min之间原花青素的得率趋于平缓，在25 min后趋于减弱。根据实验结果在其他条件不变的情况下，选取15 min为适宜超声时间。

图1 超声时间对原花青素得率影响

2.2.2 超声温度对棕色棉纤维原花青素提取率的影响称取棉纤维0.10 g，加入5 mL 80%甲醇研磨，选取不同温度(30℃～70℃)进行试验，采用上述的方法测定原花青素含量。由图2可以地看出，当温度接近50℃左右时，原花青素的提取率有所提高，但是温度继续上升，原花青素产量呈现明显的下降趋势，其原因可能和超声温度提高，原花青素结构不稳定有关，直接影响其化学变化。因此，将温度40℃～60℃作为响应面试验涉及的温度范围。

图2 超声温度对原花青素得率影响

2.2.3 料液比对原花青素提取率的影响 称取棉纤维0.10 g，分别选取不同比例的料液比(1:40～1:65 g/mL)，通过盐酸的正丁醇显色反应，在550 nm处测定吸光度，并计算原花青素的得率。结果显示，随着料液比的增大，棕色棉的原花青素得率缓慢增加，料液比为1:60以后，原花青素得率下降（图3）。随着萃取溶剂的增加，原花青素的提取率越高，当溶剂比例过大时，溶液中的原花青素提取量达到饱和，浓度降低，造成试剂等材料的浪费。因此，本次实验确定料液比1:60左右为最佳，并把料液比1:55～1:65 g/mL作为响应面分析设计的观察范围。

图3 料液比对原花青素得率影响

2.2.4 甲醇浓度对棕色棉原花青素提取率的影响 称取棉纤维0.10 g，分别选取不同比例的甲醇浓度(75%～95%)进行试验，按照上述同样方法测定原花青素的得率。结果表明，随着甲醇体积分数增大，棕色棉原花青素得率值相应增加，85%甲醇体积分数在原花青素提取时得率最高，当甲醇体积分数大于85%时，提取率稍微下降，而甲醇体积分数超过90%后，得率继续降低（图4）。推测可能由于甲醇体积分数升高，这导致醇溶性、色素、亲脂性强的杂质溶出率持续性增加，这些物质更加容易和醇水结合，影响原花青素的溶出[13]。因此本次实验确定甲醇体积分数为85%左右，提取的得率效果最佳，并把甲醇体积分数80%～90%作为响应面法的设计观察范围。

2.3 响应面法优化棕色棉纤维原花青素提取工艺

2.3.1 响应面分析试验方案 提取条件按照Design Expert 8.0.5软件中的Box-Behnken设计进行，实验结果见表2。

表2 响应面试验的结果

2.3.2 回归方程分析 对实验测定的原花青素得率进行回归分析，构建二次回归模型。

由方差分析（表3）的结果可知，该模型的f值3.00表明模型显著，只有由于噪声的存在，出现如此大的“模型f值”的概率为2.44%，小于0.0500的“Prob＞F”值，表明模型显著，对实验拟合情况较好。信噪比(Adeq Precisior)值为5.775，表示信号足够，此模型可用于此次实验的设计。实验结果表明C影响极其显著，A2、C2、D2等因素与原花青素提取率关系密切。

表3 方差分析

综上分析可知，该模型适合用于分析和预测棕色棉纤维原花青素提取能力，4种影响因子对提取率的影响程度依次为：超声温度＞甲醇浓度＞超声时间＞料液比。

2.3.3 响应面法优化原花青素提取工艺 为了更好的系统地分析各因素对于原花青素提取的效率，使用响应面法分析各个因素间的交互作用对原花青素提取效果的影响，其响应曲面图及其等高线图如图5。等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，高度越高等高线密度越大，代表两因素交互关系较为显著，相互影响也较大。由图5可知，料液比、提取时间、甲醇浓度和提取温度间的交互关系均出现弧形关系，得到的响应面结果都具有一个极大值点，并且甲醇含量、料液比、提取时间和提取温度的相互反应等高线呈椭圆形，对提取率的影响较为显著。

图5 不同因素对原花青素提取效果影响的响应面图形和等高线

2.3.4 最优原花青素提取工艺参数 基于选取的各因素范围，通过Design Expect软件分析及回归模型，得出原花青素最优提取条件为：甲醇浓度83%，料液比1:60.34 g/mL，超声温度41.56℃，超声时间18 min，在此条件下，原花青素提取率的预测值为7.32%。考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数稍作调整为:甲醇浓度83%，料液比1:60 g/mL，超声温度42℃，超声时间为18 min。

为检验响应曲面法测定结果的可靠性，采用上述优化提取条件重复实验3次，原花青素提取率为(7.16±0.03)%，与模型理论最大值(7.31%)接近，说明模型可以优化原花青素提取的条件，也说明了响应面法对原花青素的提取条件参数进行适当的优化是可行的。实验中，通过几种不同方法对原花青素提取得率进行比较，结果发现，优化后的甲醇-盐酸正丁醇的方法提取原花青素的得率最高，平均值6.5%以上，依次是双酶法，提取率大约为5.5%（图6）。

图6 不同方法提取原花青素的得率

3 讨论

植物中原花青素提取有很多方法，如微波辅助法、双酶法等。本研究将甲醇-盐酸正丁醇与超声辅助技术相结合，通过进一步优化甲醇浓度、料液比、超声时间和温度等条件，最大限度提高原花青素的提取率，获得最佳棕色棉纤维原花青素的提取工艺。

在原花青素提取的过程中，目标产物受溶剂的浓度、超声时间和温度、料液比等多种因素的影响，其中甲醇浓度在一定的范围内会影响目标产物的得率，一般随着甲醇浓度的升高而暂时的上升，但当甲醇浓度超过85%的时候，得率不会发生显著地变化，甚至还会下降。这种差异产生的可能原因是由于甲醇浓度过高，其他物质溶出较多，竞争加剧；也有可能是甲醇过多，容易挥发，影响反应的效率，导致提取率的下降。吴春等[32]用丙酮提取原花青素的最佳料液比为1:20，相较于丙酮危害性而言，选取低毒的甲醇更具安全性，并且拥有更好的效果。本试验用甲醇提取原花青素的最佳料液比为1:60，与硫酸-香草醛法[33]测定葡萄籽中原花青素含量相比差异明显，这种差异可能是由于提取试剂和提取原料以及检测方法的不同所致，在以往的报道中，原花青素多从葡萄籽中进行提取，然而棕色棉中原花青素与葡萄籽中原花青素组成单元成分差异较大，组成成分不同，不同提取试剂的极性不同，所以选取不同的提取试剂，均会产生较大差异，如果能寻找到最佳的提取工艺，目标产物得率会达到最高。在本试验中最佳甲醇浓度为83%，这可能是此浓度与提取的原花青素极性相当的原因。在提取的过程中，温度的升高有助于加速溶剂中分子运动的速度，原花青素扩散到溶剂中的速度加快，从而选取合适的超声温度使原花青素的得率增加，但温度过高又会破坏原花青素结构，而且还易使其他杂质渗出，对后期的含量检测有一定影响。因而提取过程中的温度不宜设置的过高，本试验经优化最佳温度为42℃，这与宋应华等[34]得出原花青素的浸提温度为50℃略有不同，差异可能与材料的品种差异、种植地、气候，处理方法等因素有关。在提取时间上缩短为18 min为最佳，与其他方法的提取时间比较，发现本实验提取时间有所缩短，可能是防止原花青素进一步氧化聚合，从而影响得率。综上所述，通过单因素实验研究甲醇浓度、料液比、超声时间和超声温度对棕色棉纤维中原花青素提取率的影响，在响应面回归分析法的基础上，获得了棕色棉纤维原花青素提取的最佳的工艺参数，虽然本文对棕色棉纤维原花青素进行了提取分离，但前体单元的不同对原花青素聚合后的结构功能影响巨大，后期生物学活性及功能需要更加深入的研究。

4 结论

本实验通过响应面法优化了棕色棉纤维原花青素的提取条件，结果显示棕色棉纤维原花青素最佳提取工艺参数为：甲醇浓度为83%，料液比1:60 g/mL，超声温度42℃，超声时间18 min，在此条件下的提取率为(7.16±0.03)%，比一般方法提高4%左右，实验结果也可应用其他植物的原花青素提取，并能进行批量提取，为今后原花青素的生物活性研究和产品开发奠定了基础。