红芪总黄酮对离心运动大鼠骨骼肌细胞 NF-κB信号通路相关凋亡蛋白表达的影响

杨雅丽，马玉德，段云燕，陈 彻，王 勇，李海龙

(甘肃中医学药大学·甘肃 兰州 730000)

甘肃地道药材红芪为豆科植物多序岩黄芪(Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz)的干燥根，是黄芪中的上品，有补气神药之誉，具有补气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等多种功效。现代药理学研究表明红芪中含有一类低分子黄酮类化合物(flavanoids)[1-2]，作为可终止自由基产生的天然抗氧化剂已在医学研究领域引起了相应的关注[3-5]。课题组前期研究已经证实，采用红芪总黄酮进行干预，能够降低离心运动后大鼠骨骼肌中的NO、LDH、MDA、ROS的含量，并提高SOD的活性，提示红芪总黄酮可降低大强度运动后引发的氧化应激反应，从而减轻骨骼肌损伤，可增强大强度离心运动大鼠的耐力[6-7]。但是，红芪总黄酮是否能在基因表达层面抑制离心运动引起的骨骼肌细胞凋亡尚未见报道。

本研究以NF-κB信号通路为切入点，通过建立离心力竭运动模型，观察一次性离心力竭运动下大鼠骨骼肌细胞凋亡及NF-κB信号通路相关分子bcl-2、bax、cyt-c、caspase-3基因和蛋白表达的变化，观察离心力竭运动对NF-κB信号通路的影响，探讨该运动方式引起的骨骼肌细胞凋亡的信号转导机制；并用红芪总黄酮进行干预，从NF-κB 信号转导通路及细胞凋亡层面进一步探讨其抗运动疲劳和损伤的分子机制。

1 材料和方法

1.1 药物与主要试剂 红芪为甘肃陇西产道地药材，其总黄酮由本研究室分离和纯化，含量经测定为32.7%。TRIzol：美国Ambion；反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒：美国Promega；RIPA裂解液和BCA试剂盒：西安晶彩；蛋白酶抑制剂：北京艾德莱；pNF-κB抗体：北京天德悦；Bcl-2、Bax抗体：美国Bioworld；Cyt c、Caspase-3抗体：美国CST；山羊抗兔二抗：美国Affinity；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒：碧云天；高敏ECL发光试剂：美国Bio-BAD；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验动物 3月龄清洁级健康雄性 Wistar 大鼠24只，体质量200～250 g，由甘肃中医药大学动物中心提供，动物许可证号：SCXK(甘)2011-0001。大鼠喂养环境温度为17～23 ℃，相对湿度为50%～60%。所有大鼠常规喂养，分笼饲养，自由饮食，保持12 h光照。

1.3 实验分组与给药处理 大鼠进行适应性训练(速度为16 m/min，坡度为-16°，时间为5～10 min)3 d后，随机分为安静对照组(Control group，CG)、离心运动组(Eccentric Group，EG)和离心运动联合药物预处理组(Drug pretreatment Group，DPG),每组8只。离心运动前3 d，DPG组大鼠每日定时给予0.2 mg/kg红芪总黄酮灌胃，CG组、EG大鼠给予等量生理盐水灌胃。EG组、DPG组大鼠均采用恒定速度20 m/min，-16°下坡跑台中做离心运动，直至力竭；不能坚持运动的大鼠休息 2 min后继续运动，从跑台拿出呈明显疲劳状且无逃避能力时，判定为离心力竭运动完成[8]。各组大鼠在预设时间用7% 水合氯醛按大鼠体质量(0.4 mg/100 g)进行腹腔注射麻醉，分离腓肠肌，并放入 4 ℃ 预冷的生理盐水中清洗，滤纸吸干后锡纸包裹，标记后放入液氮中冰冻保存待测。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 RT-qPCR实验 按照Trizol的TaKaRa-RNA定量和反转录试剂盒说明书，提取大鼠骨骼肌细胞总RNA，内参为GAPDH。引物序列为：NF-κB(120bp)上游：5′-TGA GTCCCGCCCCTTCTAAA-3′，下游：5′-CCTGGATCACTTCAATGGCCT-3′；bcl-2(144bp)上游：5′-AACATCGCCCTGTGGATGAC-3′，下游：5′-GGTCTTCAGAGACAGCC AGG AG-3′；bax(102bp)上游：5′-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游：5′-CGTGTC CACGTCAGCAATCA-3′；caspase-3(128bp)：上游：5′-GGCCTGAAATACC AAGTCA GGAA-3′，下游：5′-CCATGGCTTAGAATCACACACACA-3′；cyt-C(110 bp)上游：5′-GTTGGACAGCCC CGAT-GTTAG-3′，下游：5′-TTGAGAAAGGGAAAGGCAGTGAT G-3′；GAPDH(79 bp)上游：5′-AGGAAATGATGACCTCCTGAACT-3′，下游：5′-TGT TTTTGTAAGTATCTTGGTGCCT-3′。PCR反应条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s。退火1 min后采集信号，重复40次循环。用2-ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达量。

1.4.2 Western blotting实验 取50～100 mg大鼠肌肉组织，加入蛋白抽提剂500(L剪碎匀浆，BCA蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，300 mA恒流转膜，3%BSA封闭。4 ℃孵育一抗pNF-κB(pp65)(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)过夜。第二天恢复至室温30 min，TBST洗膜5次，每次5 min。5%脱脂奶粉配制二抗(1∶8 000)，室温孵育2 h。TBST洗膜5 min×5次。按照比例配置ECL发光液，凝胶成像系统成像分析。以NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyt c蛋白条带与GAPDH条带之比进行分析。结果用Image Lab Software 5.2分析，然后用GraphPad Prism 8软件作图分析。

1.4.3 TUNEL染色 按照试剂盒说明书操作。每张切片随机拍摄5 个视野进行阳性细胞计数，以凋亡阳性细胞数所占百分比的平均值作为凋亡指数(apoptotic index，AI)。

2 结果

2.1 红芪总黄酮对离心运动大鼠骨骼肌NF-κB、bcl-2、bax、cyt c、caspase-3 mRNA表达的影响 见表1。RT-qPCR结果显示，与CG组比较，EG组和DPG组NF-κB、bax、cyt c、caspase-3 mRNA的表达均显著性升高(P<0.05)，bcl-2 mRNA的表达明显下降(P<0.05)；与EG组比较，DPG组NF-κB、bax、cyt c、caspase-3 mRNA的表达均显著性降低(P<0.05)，bcl-2 的mRNA表达明显增高(P<0.05)。

表1 各组大鼠骨骼肌NF-κB、bax、bcl-2、cyt c、caspase-3 mRNA表达的比较

2.2 红芪总黄酮对离心运动大鼠骨骼肌pNF-κB、Bcl-2、Bax、Cyt c、Caspase-3蛋白表达的影响 见图1。Western blotting结果显示：与CG组比较，EG组和DPG组NF-κB、Bax的表达显著增高(P<0.05)，Bcl-2的表达显著降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.05)；与EG组比较，DPG组NF-κB、Bax的表达明显降低(P<0.05)，Bcl-2的表达明显增高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值显著增高(P<0.05)。与CG组比较，EG组和DPG组Cyt c、Caspase-3的表达显著增高(P<0.05)；与EG组比较，DPG组Cyt c、Caspase-3的表达明显降低(P<0.05)。

图1 红芪总黄酮对离心运动大鼠骨骼肌NF-κB、Bcl-2、Bax、Cyt c、Caspase-3蛋白表达的影响

2.3 红芪总黄酮对离心运动大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响 Tunel染色阳性的凋亡细胞显色为棕色，苏木素染色的细胞核显色为蓝色。EG 组有少数散在的凋亡细胞，EG 组出现较多的凋亡细胞，DPG组凋亡细胞数量较EG组有所减少。TUNEL 染色后结果表明，各组大鼠骨骼肌细胞凋亡指数分别为：CG组(2.9±0.6)%、EG组(21.6±1.9)%、DPG组(12.5±1.7)%；与CG组比较，EG组、DPG组大鼠骨骼肌细胞凋亡指数显著升高(P<0.01)；与EG组比较，DPG组大鼠骨骼肌细胞凋亡指数显著降低(P<0.05)。

3 讨论

适度运动可以增加机体的耐力和适应能力，达到强身健体的作用；但如果长时间超负荷运动，特别是力竭运动，势必会对机体造成不同程度的损伤。运动性骨骼肌微损伤(Exercise-Inducer Muscle micro-Injury，EIMmI)指的是在不习惯运动或者高强度运动条件下，引起的肌肉体积变大、肌肉酸痛、肌肉力量变化及关节活动度缩小等情况。该运动经常会导致延迟性肌肉酸情况的发生[9]。运动性骨骼肌损伤除包含骨骼肌组织超微结构异常之外，还包括蛋白水平、基因及分子水平的异常。离心运动是致骨骼肌微损伤的主要运动方式，研究表明，骨骼肌细胞损伤过程中，细胞凋亡发挥着重要的作用[10-11]。引发力竭性训练导致肌肉酸痛和运动能力降低的主要病理生理机制可能是骨骼肌细胞凋亡。本实验采用一次性大强度下坡跑训练方式，建立大鼠骨骼肌损伤模型，研究发现大鼠在经过一次性离心力竭运动后，骨骼肌细胞发生了细胞凋亡，其凋亡指数在运动后即刻明显升高，与正常对照组有显著的差异，而红芪总黄酮干预后凋亡指数明显下降，红芪总黄酮可显著抑制离心运动后的骨骼肌细胞凋亡。

NF-κB是细胞核内重要核转录因子，在细胞浆中与其抑制因子I-κB结合，呈非活性状态。当受到如细胞因子、内毒素、病毒、活性氧自由基、钙离子载体、紫外线及射线等信号刺激时活化，进入细胞核与靶基因增强子上的特异性位点结合，参与应激反应、炎症和细胞凋亡相关基因的转录[12]。NF-κB可通过对其下游基因如bcl-2、bax及cyclinD1的转录调控来实现对细胞的增殖分化、凋亡与细胞周期的控制[13-14]。本实验研究发现，一次性离心力竭运动后大鼠骨骼肌细胞NF-κB有效激活，可能参与了力竭运动对机体骨骼肌细胞凋亡的诱发。

NF-κB的激活是细胞凋亡通路的始动因素，对细胞凋亡产生关键调节因素的是Bcl-2家族成员的比例关系。在Bcl-2家族中最常见基因包括3 种[15]：第一种为促细胞凋亡基因，以Bax为代表，又被称为抑癌基因。第二种为抗细胞凋亡基因，以Bcl-2为主要代表，也被称为原癌基因。第三种为Bcl-2同源基因，代表基因为Bik、Blk、Bad和Bid等，主要发挥促进细胞凋亡作用。Bax与 Bcl-2形成异源二聚体，使得Bcl-2失去抑制细胞凋亡活性；Bax还可单独形成同源二聚体，从而达到促进细胞凋亡作用。Bcl-2/Bax 异源二聚体是引发细胞凋亡调节的主要因素，这一比值决定了细胞凋亡与否：比值升高可抑制细胞凋亡，而比值下降则促进细胞凋亡[15-16]。Bax 还可通过线粒体外膜产生通道，并且诱导线粒体内的细胞色素 C 等进入细胞质，能有效激活凋亡相关蛋白酶 Caspase[17]。在Caspase家族中，Caspase-3是一种主要的凋亡效应因子，Caspase-3激活后，可以诱导细胞凋亡，并影响其他凋亡因子共同诱导细胞凋亡[18]。本研究结果显示，在一次离心力竭运动后，EG组和DPG组骨骼肌组织NF-κB、Bax、Cyt c、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达明显升高，而Bcl-2 mRNA和蛋白的表达却显著减低，证明离心力竭运动的确可以造成骨骼肌细胞凋亡。DPG组与EG组相比，离心力竭运动后DPG组骨骼肌组织NF-κB、Bax、Cyt c、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达明显降低，而Bcl-2 mRN和蛋白的表达显著增高。提示：红芪总黄酮可通过降低离心力竭运动大鼠骨骼肌细胞NF-κB、Bax、Cyt-c、Caspase-3蛋白的表达，升高Bcl-2蛋白的表达，抑制离心运动后的骨骼肌细胞凋亡。

综上所述，一次离心力竭运动可激活大鼠骨骼肌细胞NF-κB信号分子，启动细胞的凋亡程序；红芪总黄酮能够降低大强度运动后氧化应激所导致的骨骼肌损伤，其机制可能与降低骨骼肌组织NF-κB、Bcl-2/Bax、Cyt c、Caspase-3 表达水平，抑制骨骼肌细胞凋亡有关。