湿浊内蕴证、脾肾两虚证慢性肾衰患者肠道菌液对黄芪水提物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷体外代谢的影响

李鑫靓，张树明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

黄芪具有补气固表、利尿托毒功效，是治疗慢性肾衰的临床常用药之一。毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪最具活性的主要成分之一，具有明显的抗氧化、抗病毒、免疫抑制等多种药理作用[1]，同时也是中国药典对黄芪进行质量控制的主要成分之一。目前研究慢性肾衰患者肠道菌群体外对其代谢影响的较少，因此本实验以黄芪水提物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷为检测对象，采用肠道菌液体外培养代谢的方法，来探究脾肾两虚证及湿浊内蕴证慢性肾衰患者肠道菌液体外对毛蕊异黄酮葡萄糖苷的代谢变化差异,为临床不同证型患者用药提供参考依据。

1 实验材料

1.1 样本来源 采集黑龙江省中医药科学院肾病科湿浊内蕴型、脾肾两虚型住院患者及该院体检中心健康人的粪便样本各10例作为实验样本。

1.2 实验材料 黄芪购于北京同仁堂哈尔滨中山路店，经检测符合中国药典标准。GAM培养基：海博生物技术有限公司，编号：HB8518-1；EE肉汤：海博生物技术有限公司，编号：HB0126；氯化钠注射液：哈尔滨三联药业股份有限公司；甲醇(色谱纯)：美国Tedia公司；乙腈(色谱纯)：美国Tedia公司；其余溶剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

1.3 实验仪器 Waters2695高效液相色谱系统：美国Waters公司；Waters2489荧光检测器：美国Waters公司；BSA-224S-CW电子天平：德国赛多利斯公司；37 ℃恒温培养箱(上海一恒有限公司)；冷冻离心机：德国赛默飞世尔公司；DL-CJ-1N型超净台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；WH-Z微型涡旋混悬仪：北京京立离心机有限公司；-80 ℃冰柜：SANYO Electric Co.，Ltd。

2 实验方法

2.1 药液制备 称取黄芪60 g，分别加入10倍量、8倍量、8倍量水煎煮3次，均为武火水沸腾后，文火煎煮30 min，纱布过滤。合并滤液水浴浓缩后105 ℃烘干，研成粉末备用。实验前取该粉末5 g加入10 mL水制成0.5 g/mL黄芪水提取物药液。

2.2 菌液制备 取每份样本0.6 g，加入2.4 mL生理盐水，涡旋3 min，5 000 r/min离心5 min分离获得上清液。分别取上清液1 mL，按1∶9分别厌氧培养基、好氧培养基后涡旋混匀，在厌氧及好氧条件下37 ℃培养24 h，制成肠道厌氧菌液、肠道好氧菌液。

2.3 样品处理 分别取各样本的肠道厌氧、好氧菌液160 μL，各加入40 μL药液，混匀后37 ℃进行厌氧和好氧培养，分别于0、4、12、24 h取出平行样，加入5倍量的甲醇溶液终止代谢。涡旋3 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液氮气吹干，加入100 μL甲醇复溶，过滤膜到进样瓶中作为样品待测。

2.4 色谱条件 色谱柱：WatersC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；Waters荧光检测器，检测波长：254 nm。流动相参数设置条件参考刘玲等[2]条件。测定各时间点样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，同时计算0～4 h、4～12 h、12～24 h时段的代谢速率及0～4 h、0～12 h、0～24 h时段的累积代谢速率。

2.5 统计学方法 采用SPSS23.0统计学软件分析，数据以均值±标准差表示，选择重复测量方差分析。以P<0.05表示统计学具有显著性差异。

3 实验结果

3.1 各组肠道菌液对黄芪水提物毛蕊异黄酮葡萄糖苷不同时间点含量的影响 见表1～表2。

表1 好氧条件下各组肠道菌液对黄芪水提物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷不同时间点含量的影响

表2 厌氧条件下各组肠道菌液对黄芪水提物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷不同时间点含量的影响

实验结果表明：在好氧条件下，各组随时间的延长在4、12、24 h时间点与其前一时间点比较毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均大幅下降。与健康对照组比较：毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量湿浊内蕴组各时间点均降低，但只有4 h时具有显著性差异(P<0.05)，脾肾两虚组除24 h降低外其余各时间点均有所增高，但均无显著性差异(P>0.05)。

实验结果表明：在厌氧条件下，各组随时间的延长在4、12、24 h时间点与其前一时间点比较毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量大幅下降。与健康对照组比较：毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量湿浊内蕴组各时间点均降低但只有4、24 h时具有显著性差异(P<0.05)；脾肾两虚组除各时间点均有所增高，但均无显著性差异(P>0.05)。

3.2 各组肠道菌液对黄芪水提物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷不同时段代谢速率的影响 结果见表3～表4。

表3 好氧条件下各组肠道菌液对黄芪水提物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷不同时段代谢速率的影响

表4 厌氧条件下各组肠道菌液对黄芪水提物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷不同时段代谢速率的影响

实验结果表明：在好氧条件下，各组第二、三时段与第一时段相比毛蕊异黄酮葡萄糖苷代谢平均速率均下降，健康对照组第三时段、湿浊内蕴组第二、三时段具有显著性差异(P<0.05)，各组第三时段与第二时段相比除健康对照组下降外其余两组均升高，脾肾两虚组具有显著性差异(P<0.05)。与健康比较,脾肾两虚组第一、二时段下降但无显著性差异(P>0.05)，第三时段升高具有显著性差异(P<0.05)；湿浊内蕴组第二时段下降但无显著性差异(P>0.05)，第一、三时段升高具有显著性差异(P<0.05)。

实验结果表明：在厌氧条件下，各组第二、三时段与第一时段相比毛蕊异黄酮葡萄糖苷代谢速率均下降，健康对照组第三时段、湿浊内蕴组第二、三时段具有显著性差异(P<0.05)，各组第三时段与第二时段相比除健康对照组下降外其余两组均升高，均无显著性差异(P>0.05)。与健康比较脾肾两虚组第一时段下降、第三时段升高但无显著性差异(P>0.05)，第二时段下降具有显著性差异(P<0.05)，湿浊内蕴组各时段均升高，第一时段具有显著性差异(P<0.05)其余无显著性差异(P>0.05)。

3.3 各组肠道菌液对黄芪水提物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷累积代谢速率的影响 见表5～表6。

表5 好氧条件下不同时间点各组患者肠道菌群对毛蕊异黄酮葡萄糖苷累积代谢速率的影响

表6 厌氧条件下不同时间点各组患者肠道菌群对毛蕊异黄酮葡萄糖苷累积代谢速率的影响

实验结果表明：在好氧条件下，各组第二、三时段与第一时段相比毛蕊异黄酮葡萄糖苷累积代谢速率均下降，健康对照组第二、第三时段、湿浊内蕴组第二、三时段具有显著性差异(P<0.05)，各组第三时段与第二时段相比各组均下降，健康对照组、湿浊内蕴组第三时段具有显著性差异(P<0.05)。与健康组比较毛蕊异黄酮葡萄糖苷累积代谢速率，脾肾两虚组第一、二时段下降、第三时段升高但无显著性差异(P>0.05)，湿浊内蕴组各时段均升高、第一时段具有显著性差异(P<0.05)。

实验结果表明：在厌氧条件下，各组第二、三时段与第一时段相比毛蕊异黄酮葡萄糖苷累积代谢速率均下降，湿浊内蕴组第二、三时段具有极显著性差异(P<0.01)，各组第三时段与第二时段相比各组均下降，健康对照组、湿浊内蕴组第三时段具有显著性差异(P<0.05)。与健康比较脾肾两虚组第一时段升高，第二、三时段下降但均无显著性差异(P>0.05)，湿浊内蕴组各时段均升高，只有第一时段、第三时段具有显著性差异(P<0.05)。变化趋势湿浊内蕴组具有显著性差异(P<0.05)；与湿浊内蕴组比较脾肾两虚组各时段下降，但第二时段有极显著性差异(P<0.01)、第三时段具有显著性差异(P<0.05)。

4 讨论

黄芪作为补气药在治疗慢性肾衰临床处方中起到重要作用[3-6]。毛蕊异黄酮葡萄糖苷是中国药典规定黄芪成分含量测定的主要成分之一。药物口服进入肠道后必然与肠道菌群接触，肠道菌群对药物成分如何影响目前是学者关注的热点。本研究参照临床汤剂的制备方法制成了黄芪水提物溶液，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为检测指标进行了肠道菌液在厌氧及好氧条件下对黄芪水提物溶液影响的研究。本研究表明：脾肾两虚组与湿浊内蕴组患者肠道菌群对黄芪水提物溶液毛蕊异黄酮葡萄糖苷代谢均有一定影响，但以湿浊内蕴组影响更为显著，并且两组间也存在显著差异。进而表明无论脾肾两虚证还是湿浊内蕴证慢性肾衰患者肠道菌群结构较健康人群均发生明显变化，并且脾肾两虚证患者、湿浊内蕴证患者同样存在差异。肠道菌群对含糖苷键中药成分水解反应是其影响代谢的最主要方式之一[7]，陈烁吉[8]等研究表明肠道是毛蕊异黄酮葡萄糖苷最主要的代谢场所，Ruan等人[9]还认为毛蕊异黄酮葡萄糖苷在肠道内经肠道菌群代谢水解代谢成其苷元——毛蕊异黄酮，并且毛蕊异黄酮具有促进血管内皮新生、保护内皮细胞减轻其凋亡的作用[10-12]。结合文献报道和本实验结果，可推导黄芪水提物溶液经慢性肾衰患者肠道菌群作用毛蕊异黄酮葡萄糖苷代谢为毛蕊异黄酮而发挥保护肾脏内皮细胞作用，从而达到治疗慢性肾衰的目的。并且黄芪水提物溶液发挥保护肾脏的作用在湿浊内蕴证慢性肾衰患者表现更为突出。上述推论本课题将在后续工作中进一步验证。