四逆汤配方颗粒和饮片煎剂抗心肌损伤作用的比较研究

余 平，谷丽丽，李 钦，葛淑瑜，楼婷婷

(1浙江省立同德医院·浙江 杭州 310012；2杭州医学院·浙江 杭州 310013)

近年来随着中药新剂型不断发展，除传统饮片煎剂外，还出现了中药配方颗粒等新剂型。中药配方颗粒是用符合炮制规范的单味中药饮片为原料，利用现代化的生产工艺和技术，将单味饮片的全成分经提取、浓缩、干燥、制粒、包装而成，统一规格、剂量，用于中医临床调剂使用的新型剂型。与传统饮片相比较，中药配方颗粒具有使用方便、卫生、调剂准确、安全有效且易于携带等众多优点，但是配方颗粒作为一种中药新剂型，其药效与传统饮片煎剂是否存在差异，是配方颗粒能否被社会接受的关键[1-2]。加强对有确切疗效的经典方剂的中药配方颗粒与饮片煎剂的等效性研究[3-4]，对推进中药配方颗粒的临床应用，具有理论与实际意义。

四逆汤是汉代张仲景《伤寒论》中用于治疗少阴虚寒证的主方，由附子、干姜、炙甘草组成。具有温中祛寒、回阳救逆之效[5]，临床应用广泛，现代临床研究显示四逆汤对改善心肌缺血再灌注造成的损伤、治疗心力衰竭、对抗急性缺血性心肌梗死、增强心肌收缩力以及治疗冠心病、心绞痛方面具有良好的疗效[6]。本文通过心肌细胞缺氧损伤模型和大鼠离体心脏缺血再灌注(I/R)模型比较四逆汤配方颗粒与饮片煎剂之间药效学方面的一致性。

1 材料

1.1 实验药物 四逆汤传统饮片煎剂(附子∶干姜∶炙甘草=3∶2∶3)，浓度以附子饮片量计，每毫升含3 g附子饮片量，由浙江景岳堂药业有限公司制备提供；四逆汤配方颗粒由浙江景岳堂药业有限公司提供产品，附子颗粒剂1 g相当于附子饮片6 g，干姜颗粒剂1 g相当于干姜饮片6 g，炙甘草颗粒剂1 g相当于甘草饮片3 g。颗粒剂组方按照饮片药量比例换算，即附子∶干姜∶炙甘草=1.5∶1∶3。取附子颗粒剂1.5 g，干姜颗粒剂1 g，炙甘草颗粒剂3 g(相当于附子饮片9 g、干姜6 g、炙甘草9 g)，溶解于45 mL蒸馏水，浓度以附子饮片量计，即为本实验中颗粒组母液200 g·L-1。

细胞实验时，配方颗粒母液和饮片煎剂经0.22 μm膜过滤除菌，临用时采用细胞培养基分别稀释成浓度1.25、2.5、5.0、10.0 g·L-1。大鼠离体心脏缺血再灌注实验时，四逆汤配方颗粒和饮片用Ringer-Locke液配成0.5、2.0、4.0 g·L-1含药灌流液。

1.2 细胞与动物 大鼠乳鼠心肌细胞株(H9c2)购自中国科学院细胞库。将H9c2细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。SPF级SD大鼠80只，雌雄兼用，体质量(250±50)g，均由浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK(浙)2014-0001。常规颗粒饲料喂养，自由饮水，12 h昼夜节律。

1.3 主要试剂 胎牛血清：杭州四季青公司，批号：19110501；DMEM高糖培养基：美国Hyclone公司，批号：AE29449068；MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-四氮唑溴盐]、二甲基亚砜(DMSO)、活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)和脂质过氧化(MDA)试剂盒：上海碧云天生物公司，批号分别为：ST316、ST038、S0033、C0016和S0131；过氧化氢(H2O2)(3%)：广东恒建制药有限公司。批号：181002

1.4 实验仪器 3111型CO2培养箱：美国Thermo 公司；SW-CJ-1F型超净工作台：苏净安泰公司；AEL-200电子天平：日本岛津公司；Microfuge16离心机：美国贝克曼公司；Synergy-2 SLFPA全波长多功能酶标仪：美国伯腾公司；DMI3000B荧光倒置显微镜：Leica公司；ZH-LGF离体心脏灌流装置：淮北正华生物仪器设备有限公司；SC-15数控超级恒温槽：宁波天恒仪器厂；MP150十六道生理记录仪：美国 BIOPAC公司。

2 方法

2.1 细胞存活率检测 MTT法。以DMEM高糖培养液培养H9c2细胞，调整细胞密度为5×104个/mL，100 μL/孔接种于96孔板中，每组设6个复孔，设调零孔(只加入等量培养基，不含细胞)，并按如下分组：1)空白对照组，1.25、2.5、5.0、10.0 g·L-1四逆汤配方颗粒和饮片煎剂组，作用24 h。2)正常对照组、H2O2组(模型组)，配方颗粒组(H2O2与配方颗粒2.5、5.0、10.0 g·L-1共处理)、饮片煎剂组(H2O2与饮片煎剂2.5、5.0、10.0 g·L-1共处理)，除正常组外，其余组均采用250 μmol·L-1H2O2作用3 h。配方颗粒组和饮片煎剂组加入含药物培养基100 μL预处理24 h，再加入H2O2。其后，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，继续培养4 h。吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，于酶标仪490 nm测定吸光度(A)值，计算细胞存活率和半数抑制浓度(IC50)。存活率(%)=(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100。

2.2 细胞内ROS和MDA水平检测 调整H9c2细胞密度为5×105个/mL，2 mL/孔接种于6孔板中，设立正常对照组、H2O2组、H2O2与四逆汤配方颗粒2.5、5.0 g·L-1共处理组，H2O2与饮片煎剂2.5、5.0 g·L-1共处理组。药物处理完毕后，按ROS试剂盒说明操作，每孔加入1 mL 无血清培养液稀释的DCFH-DA。37 oC细胞培养箱内孵育20 min，之后洗涤细胞3次，采用荧光显微镜观察，拍照,每组选取3张荧光图片，采用Image J软件分析计算荧光强度值。另按上述分组，药物处理完毕之后裂解细胞，离心按MDA试剂盒说明操作并计算MDA含量。

2.3 细胞培养液中LDH释放检测 调整H9c2细胞密度为5×104个/mL，100 μL/孔接种于96孔板中，设立背景空白组、正常对照组、LDH最大释放组、H2O2组，H2O2与四逆汤配方颗粒2.5、5.0 g·L-1共处理组，H2O2与饮片煎剂2.5、5.0 g·L-1共处理组。收集各组细胞培养液，按LDH试剂盒说明操作，LDH释放率(%)=(A药物处理-A正常对照孔)/(A细胞最大酶活性-A正常对照孔)×100。

2.4 大鼠离体心脏缺血再灌注损伤保护作用实验 SD大鼠随机分为正常对照组、I/R组、四逆汤配方颗粒和饮片煎剂0.5、2.0、4.0 g·L-1剂量组，每组10只。离体大鼠心肌I/R模型的制备参考文献[7]。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，迅速将心脏固定于Langendorff离体心脏灌流装置上，用95%O2与5%CO2的饱和Ringer-Locke液进行灌流，灌流液温度维持在(37.0±0.5)℃。将一球囊导管经房室瓣插入左心室，通过张力换能器连接生物信号采集处理系统。心脏稳定30 min，待心率及心肌收缩力恢复正常，调节冠脉流量约为10 mL/min；停灌30 min，然后各给药组在停灌后加入不同浓度(0.5、2.0、4.0 g·L-1)的含药灌注液，并持续整个再灌注过程；除正常对照组外，所有离体心脏均停灌30 min，再灌注30 min造成缺血再灌注损伤模型。通过系统软件记录左心室舒张末压(LVEDP)、心率(HR)和室内压最大上升速率(+dp/dtmax)及室内压最大下降速率(-dp/dtmax)，观察记录给药前及给药后各值变化情况。

3 结果

3.1 四逆汤配方颗粒及其传统饮片煎剂对正常H9c2细胞存活率的影响 将H9c2细胞分别于1.25、2.5、5.0和10.0 g·L-1四逆汤配方颗粒及其传统饮片煎剂培养24 h，与正常组相比，2.5、5.0、10.0 g·L-1四逆汤配方颗粒及其传统饮片煎剂均具有促进细胞增殖作用(P<0.01，P<0.05)，故采用2.5、5.0、1.0 g·L-1四逆汤配方颗粒和饮片煎剂进行下一步研究。2.5、5.0 g·L-1四逆汤饮片煎剂促进心肌细胞增殖作用优于颗粒剂，但二者无统计学差异。见表1。

表1 四逆汤配方颗粒和饮片对正常H9c2细胞存活率的影响

3.2 四逆汤配方颗粒及其传统饮片煎剂对氧化损伤H9c2细胞存活率的影响 将2.5、5.0、10.0 g· L-1四逆汤配方颗粒和传统饮片煎剂分别预处理H9c2细胞24 h，再进行250 μmol· L-1H2O2作用3 h，模型组细胞细胞存活率明显降低(P<0.01)，四逆汤配方颗粒2.5、5.0、10.0 g·L-1和饮片煎剂2.5、5.0 g·L-1组较之模型组细胞存活率均显著提高(P<0.01，P<0.05)。四逆汤配方颗粒效果略高于饮片煎剂组。但两组间无统计学差异。由于饮片煎剂10 g·L-1预处理较之正常组细胞存活率下降(P<0.05)，且与H2O2组无差异，故后续指标检测仅采用2.5、5.0 g·L-1两个剂量。见表2。

表2 四逆汤配方颗粒和饮片对H2O2诱导H9c2细胞存活率的影响

3.3 四逆汤配方颗粒及其传统饮片煎剂对氧化损伤H9c2细胞ROS水平的影响 本实验采用荧光探针DCFH-DA进行ROS检测，细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，见图1和表3。当H2O2处理后，细胞内DCF荧光增强，即ROS水平明显高于正常对照组(P<0.01)，而2.5、5.0 g·L-1四逆汤颗粒剂和饮片煎剂预处理后均可抑制H2O2引起ROS水平的升高(P<0.01)，但相同浓度下两组间无统计学差异。

图1 四逆汤配方颗粒和饮片对H2O2诱导H9c2细胞内ROS水平的影响(×200)

3.4 四逆汤配方颗粒及其传统饮片煎剂对氧化损伤H9c2细胞LDH释放和MDA含量的影响

细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的LDH酶释放到培养液里，将正常组的LDH释放率视为0%。如表3所示，当H2O2处理后，细胞LDH释放率达(40.0±1.8)%，而四逆汤颗粒剂和饮片煎剂干预后，LDH释放率降低，较之模型组均有显著性差异(P<0.01)，四逆汤颗粒剂与饮片煎剂各组对于减少LDH释放无明显差别。正常组MDA含量达(2.28±0.75)μmol·g-1，当H2O2处理后，细胞内MDA含量升高至(9.81±1.38)μmol·g-1，而四逆汤颗粒剂和饮片煎剂干预后，MDA水平均出现下降(P<0.01)，两组间无明显差别。

表3 四逆汤配方颗粒和饮片对H2O2诱导H9c2细胞LDH释放和MDA含量的影响

3.5 四逆汤配方颗粒及其传统饮片对大鼠离体心脏I/R损伤保护作用比较 见图2。

图2 四逆汤配方颗粒及其传统饮片对大鼠离体心脏血流动力学指标的影响

如图2A所示，大鼠离体心脏停灌30 min后再灌注可致HR减慢，复灌后I/R组HR与空白组比较有显著性差异(P<0.05)。四逆汤配方颗粒及传统饮片各剂量组与I/R组比较，均能促进复灌后HR的恢复，而同剂量配方颗粒和饮片各组间均无显著性差异。如图2B所示，离体心脏停灌30 min后再灌注，I/R组LVEDP较之正常组显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；四逆汤配方颗粒及四逆汤传统饮片各剂量组与I/R组比较，均能促进复灌后LVEDP的恢复，同剂量配方颗粒和饮片各组间均无显著性差异。如图2C和D所示,大鼠离体心脏停灌30 min后再灌注，与空白组比较，I/R组±dp/dtmax下降，可见再灌注引起心肌细胞收缩能力的减弱。四逆汤颗粒及饮片各剂量组均能促进±dp/dtmax恢复，提示配方颗粒和饮片各组改善 I/R 过程心肌收缩能力及心肌顺应性，同剂量组间均无显著性差异。

4 讨论

《伤寒论》传承至今，四逆汤作为其中的经典名方，由附子、干姜、炙甘草组成，具有温中祛寒，回阳救逆之功效，研究表明，四逆汤具有强心升压、保护缺血心肌等作用，常用于治疗多种心血管疾病，如冠心病、心力衰竭、心律失常等，均取得了较好的临床效果[8]。然而，不同制剂工艺对四逆汤药效的影响，尤其是中药配方颗粒与传统煎剂之间的疗效的等效性方面仍有待研究。本实验以药理效应为指标进行药效学等效性研究。

H9c2细胞来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，由于来源于心脏，常用于心肌疾病的研究。氧化应激是体内氧化与抗氧化作用失衡，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量自由基；其中应用最广泛的是H2O2氧化损伤模型[9]，H2O2极易透过细胞膜，与细胞内铁离子通过FENTON反应形成高活性的自由基，导致一系列反应。本实验首先观察不同剂量下四逆汤配方颗粒或其传统饮片煎剂对正常心肌细胞存活率的影响，发现四逆汤配方颗粒或其传统饮片煎剂在2.5、5.0、10.0 g·L-1剂量下对正常心肌细胞生长没有抑制作用，并且可明显促进细胞增殖，故将这3个剂量用于后续抗氧化损伤比较实验。H2O2诱导心肌细胞损伤实验结果显示2.5、5.0、10.0 g·L-1四逆汤配方颗粒预处理后均提高H2O2引起的心肌细胞存活率下降，同2.5、5.0 g·L-1饮片煎剂作用的结果，且同剂量下组间无统计学差异；另外饮片煎剂10.0 g·L-1预处理较之模型组无统计学差异，推测从本试验条件下饮片煎剂浓度大于10.0 g·L-1对抗氧化损伤作用效果减弱。LDH释放率是评价细胞膜损伤的关键因素，而ROS和MDA含量常作为分析氧化损伤的关键指标[10-11]。与模型组相比，在2.5、5.0 g·L-1剂量下四逆汤配方颗粒和饮片煎剂均降低细胞内ROS水平，减少MDA含量以及LDH释放率，同剂量下两者之间亦无统计学差异。

I/R损伤是急性心肌梗死后各种心肌再灌注治疗常见的病理生理改变，常影响再灌注治疗的效果，使心功能改善不明显，甚至出现心律失常、心肌能量代谢障碍、心肌顿抑等严重并发症。心功能是反应缺血再灌注损伤严重程度的指标，包含HR、LVEDP、dp/dtmax、dp/dtmin。HR能够反应心脏的整体功能。LVEDP能够反映舒张期左室内压变化；+dp/dtmax反映心肌收缩程度，是心室收缩功能的最敏感指标。-dp/dtmin反映心肌舒张功能，二者是评价心肌收缩性能和舒张性能的敏感指标[12-13]。本实验结果表明：0.5、2.0、4.0 g·L-1剂量下四逆汤配方颗粒和传统饮片均可改善I/R所致的LVEDP、HR和±dp/dtmax下降，在一定程度上能促进心率恢复，减轻心肌收缩和舒张功能障碍。提示四逆汤配方颗粒及传统饮片处理后对心肌缺血再灌注后的损伤有一定的保护作用，两者之间无统计学差异。

综上所述，相同剂量下四逆汤配方颗粒及其传统饮片煎剂均可以提高心肌细胞抗氧化能力，对抗H2O2活性氧自由基对心肌细胞的损伤以及改善心肌缺血再灌注损伤。两种剂型在本实验中初步表明药效学效果无明显差异，四逆汤配方颗粒剂使用较饮片煎剂更为便捷、卫生, 临床应用推广价值高。本项目组下一步将从药物化学成分含量，生物利用度等角度，以进一步考察四逆汤配方颗粒及其传统饮片的等效性，为颗粒剂替代饮片在临床应用提供依据。