硫酸-苯酚法测定六种牡丹叶中总多糖的含量

牛晓方 ，高一军 ，怀宝刚 ，尹二彦 ，马腾洲 ，李克明 ，黄利敏，王 培，侯明超，姜伟洲

（1.菏泽市立医院，山东 菏泽 274031；2.平邑县中医医院，山东 平邑 273300；3.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；4.潍坊市中医医院，山东 潍坊 261041）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.），芍药科芍药属植物[1]，落叶灌木，在我国已有1500多年的栽培历史，原种只产于我国，目前全国各省份均有栽培，并已引种国外。牡丹主要以其根皮入药，中药称之为牡丹皮，早在《神农本草经》[2]就有记载；牡丹花也可入药，在《中药大辞典》[3]中有所记载，然而对于牡丹叶的临床应用研究较少，造成了资源的浪费。近年来研究发现牡丹叶中含有多种活性成分，如黄酮类、多糖类、多酚类、芍药苷等[4]，其中有研究发现牡丹叶中的多糖类成分对羟基自由基具有清除作用[5]，本研究采用无水乙醇回流提法提取了六种不同产地的牡丹叶中的总多糖，用硫酸-苯酚法分别测定了总多糖含量，以期为牡丹叶中总多糖的研究及牡丹叶的综合合理开发总提供依据。

1 仪器

TU-1810紫外分光光度计 （北京普析通用仪器有限公司）；KQE-400B型超声清洗机（昆山超声仪器有限公司）；Metter Toledo EL2401电子天平。

2 药材与试剂

牡丹叶(产地分别为山东菏泽、安徽亳州、安徽铜陵、甘肃武威、四川垫江、山西运城);葡萄糖对照品 （SUPELCO，批号4-7829，纯度98%以上）；其余试剂均为分析纯。

3 试验方法

3.1 总多糖测定方法：

糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合形成一种橙红色的化合物，在490 nm左右有最大吸收。根据朗伯比尔定律，当波长和强度一定的入射光通过光程长度固定的有色溶液时，吸光度A和物质浓度C呈正比，计算浓度。

3.2 对照品溶液的制备：

精密称取葡萄糖对照品16.3 mg，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml含有葡萄糖16.3 μg的对照品溶液。再将对照品溶液稀释一倍，得到浓度为8.15 μg/ml的对照品溶液。

3.3 样品溶液制备：

取牡丹叶干燥样品，粉碎后，取约1 g，精密称定后，加无水乙醇回流提取2 h，滤渣挥尽乙醇后，再加60 ml水加热回流提取2次，每次1 h，抽滤，合并为提取液浓缩至10 ml，加无水乙醇使含醇量达到80%，于4oC冰箱过夜醇沉。醇沉液滤过，将沉淀用无水乙醇洗涤后，干燥得到粗多糖。将粗多糖溶于热水中，定容至25 ml，作为样品溶液。

3.4 样品测定方法：

精密吸取样品溶液0.5 ml，置于10 ml比色管中，加入6%苯酚溶液0.3 ml，再加入浓硫酸1.5 ml，混匀后，沸水浴10 min，冷至室温，以相应的空白溶液作为空白参比，490 nm测定吸光度(A)。

4 结果与讨论

4.1 线性关系考察

分别吸取的葡萄糖对照品溶液(8.15 μg/ml)，50，100，150，200，250 μl，再分别加水补齐至 500 μl，按照3.4项下的方法测定吸光度。以对照品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到葡萄糖的回归方程 y=0.1648x+0.1173，R2=0.9902，结果表明葡萄糖标准品在浓度0.815至4.075 μg/ml的范围内与吸光度呈现良好的线性关系（图 1）。

图1 葡萄糖标准曲线

4.2 精密度实验

按照3.3和3.4项下的方法，取1份样品，连续测定6次吸光度，由表1可知，RSD为0.79%，表明仪器精密度良好。

表1 精密度实验

4.3 稳定性实验

取牡丹叶适量，按照3.3项下的方法，分别于 0，1，2，3，4，6 h，测定吸光度，结果见表 2。由表2可知，供试品溶液在室温下6 h稳定性良好。

表2 稳定性实验

4.4 重复性实验

取6份样品，按照3.3和3.4项下的方法，测定吸光度，结果见表3。由表3可知，吸光度的RSD为1.25%，表明本方法重复性良好。

表3 重复性实验

4.5 加样回收率实验

精密称定已知含量的样品粉末1.0 g，共六份，分别加入适量葡萄糖对照品，按照既定方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算回收率。由表4可知，回收率RSD为2.68%，表明该方法准确度良好。

表4 加样回收实验结果(以粗多糖计)

4.6 6个不同样品的总多糖的含量测定

按照确定方法，对6个不同产地的牡丹叶进行了总多糖的含量测定，结果见表5。

表5 6种不同产地牡丹叶中总多糖的含量(以葡萄糖计算，μg/g)

5 讨论

多糖是一种维持人体生命活动的重要的大分子物质[6]，植物多糖具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等多种生物活性[7]，因而多糖的提取对于牡丹叶的综合利用具有十分重要的意义。

本实验采用无水乙醇回流法提取牡丹叶中的总多糖成分，向所得样品溶液中加入苯酚、浓硫酸后采用紫外分光光度法分别测定六种不同产地的牡丹叶中总多糖的含量，以葡萄糖为对照品，测定波长为490nm，实验结果表明葡萄糖标准品在浓度0.815至4.075 μg/ml的范围内与吸光度呈现良好的线性关系，本实验所建立的方法能准确快速地对样品中的总多糖进行测定，产地不同，牡丹叶中总多糖含量存在差异，其中以3号样地的牡丹叶总多糖含量最高，并且优势明显，后面依次排列为为5号样地，1号样地，2号样地，3号样地，以4号样地含量最低，提示在牡丹叶总黄酮的开发利用过程中可着重考虑3号样地。