多发性骨髓瘤患者血清EPO、IL-6、TNF-α、IL-1β水平及其与贫血的相关性分析

刘琳，聂鼎睿，安超，孙玲

(郑州大学第一附属医院 血液内科，河南 郑州 450052)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是浆细胞恶性增殖性疾病，特征为异常增生的浆细胞分泌单克隆免疫球蛋白或其片段[1]。贫血是MM最常见的临床症状之一，是MM的早期多因素并发症，其发生率在初诊患者中高达70%，随着疾病的进展，几乎所有MM患者均出现贫血[2]。MM患者贫血的病理生理学机制目前尚未完全明确，其中与炎性细胞因子失衡相关的慢性病贫血(anemia of chronic disease，ACD)逐渐引起研究者们的重视且被认为是MM患者贫血的主要机制之一，这些细胞因子主要包括白介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等，它们通过参与铁在储存细胞中的滞留，影响促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)的产生及直接抑制红系前体细胞等方式发挥加重贫血的作用[3]。MM与其他血液系统恶性疾病的不同之处在于包括骨骼、肾、心脏等在内的多器官损害，其中肾损害导致的EPO分泌受影响进一步复杂化了MM贫血的机制。本文旨在测量52例初诊MM患者及18例健康体检者血清EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平，探讨以上细胞因子水平在不同疾病分期的差异，并进一步分析其与贫血的相关性，为MM患者贫血机制的研究提供临床证据，也为临床MM患者贫血的治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年1月至2019年12月郑州大学第一附属医院血液内科初诊且最终确诊为MM的患者52例作为实验组。纳入标准：符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017年修订)》的诊断标准。(1)排除标准：①患有其他类型的恶性肿瘤；②患有其他肾脏疾病；③患有严重感染性或免疫相关疾病；④不能配合。实验组患者共52例，男27例；女25例，平均年龄为(59.40±8.61)岁；D-S分期Ⅰ期12例、Ⅱ期11例、Ⅲ期29例、A型38例、B型14例；ISS分期：Ⅰ期17例、Ⅱ期13例、Ⅲ期22例；免疫固定电泳结果示IgG型22例、IgA型10例、IgD型1例、游离轻链型19例。另选取同期健康体检者18例作为对照组，其中男9例，女9例，平均年龄为(52.28±6.34)岁。实验组与对照组在年龄与性别间的差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经郑州大学第一附属医院科研和临床试验伦理委员会审核批准，实验组及对照组全部成员均对本研究充分知情并签署同意书。

1.2 仪器与试剂EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平均采用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定，试剂盒购自郑州旭添生物科技有限公司。Hb水平用Sysmex XN-2000全自动血细胞分析仪检测。

1.3 研究方法所有患者和健康体检者在清晨空腹状态下抽取外周静脉血3～5 mL，按照1∶9的比例用0.109 mmol·L-1的枸橼酸钠抗凝，以3 000 r·min-1离心10 min后取上层血清(离心半径8 cm)，放置于-80 ℃的冰箱中冰冻保存待用。进行检测前，将血清样本从冰箱中取出室温下解冻，使用配套试剂盒严格按照说明书分别检测待测样本的EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平(将相应标准品和待测样本分别加入酶标板各孔中，加入酶结合物后置37 ℃温育1 h，手工洗板3次后加入显色剂，37 ℃避光显色15 min，加入终止液并在反应终止后10 min内用酶标仪检测OD450值)。另收集并统计患者一般资料包括年龄、性别、D-S分期、ISS分期、血常规(白细胞计数、红细胞计数、Hb水平、血小板计数)、血清钙离子水平、肌酐值及骨损害程度。

2 结果

2.1 EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平实验组Hb水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，实验组EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平比较

2.2 不同D-S分期IL-6、TNF-α及IL-1β水平实验组IL-6、TNF-α及IL-1β水平Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期呈递增趋势，其中IL-6水平Ⅰ期与Ⅱ期的差异无统计学意义(P>0.05)，Ⅱ期与Ⅲ期间的差异有统计学意义(P<0.05)，TNF-α、IL-1βⅠ期与Ⅱ期、Ⅱ期与Ⅲ期的差异均无统计学意义(P>0.05)，而Ⅰ期与Ⅲ期的差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 不同D-S分期EPO水平实验组Hb水平Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期呈递减趋势，Ⅰ期与Ⅱ期间的差异无统计学意义(P>0.05)，Ⅱ期与Ⅲ期间的差异有统计学意义(P<0.05)；实验组EPO水平Ⅱ期分别高于Ⅰ期及Ⅲ期，差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅲ期高于Ⅰ期，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 不同D-S分期IL-6、TNF-α及IL-1β水平比较

表3 不同D-S分期EPO水平比较[M(P25，P75)]

2.4 肾功能损害组(B型)与无肾功能损害组(A型)的EPO水平对照组EPO水平为13.21(9.70，17.68)IU·L-1，无肾功能损害组EPO水平为29.74(20.55，51.29)IU·L-1，肾功能损害组EPO水平为19.98(14.19，24.94)IU·L-1。3组间EPO水平比较，差异有统计学意义(H=25.643，P<0.001)。无肾功能损害组EPO水平高于肾功能损害组及对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；肾功能损害组EPO水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 Hb水平与EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平的相关性分析Hb水平与EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平分别呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

3 讨论

贫血是MM的常见并发症，与乏力、呼吸困难、心血管并发症、认知障碍甚至永久性器官功能损伤等相关，严重影响患者生活质量。临床上，除了积极治疗原发病外，针对贫血的治疗也十分重要。目前，MM患者贫血的治疗主要包括输注悬浮红细胞，应用重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHu-EPO)和补充铁剂[4]。成分输血可以迅速提高Hb水平，改善症状，但输血会增加感染、铁超载及过敏反应的发生风险，且输血难以长期维持Hb的水平。rHu-EPO是一种红细胞生成刺激剂，在生物学上相当于人类内源性激素EPO，应用rHu-EPO可有效提高Hb水平并且能减少红细胞的输注。目前，关于rHu-EPO治疗MM贫血的研究仍有待完善。除了rHu-EPO，也出现了一些针对其他细胞因子如IL-6和TNF-α治疗MM贫血的研究[5]。因此，对MM患者血清EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平的研究有助于了解MM患者贫血发生的机制，也有可能为MM患者带来更加个体化、更有效的治疗方式。

EPO是机体调控红系造血的重要调节因子，主要作用于定向红细胞及红细胞集落生成单位(colony-forming unit-erythroid，CFU-E)，通过与细胞膜表面的受体结合影响下游信号通路，调控红系祖细胞的生存、增殖和分化[6]。正常情况下，EPO的产生几乎只受机体氧含量调节，机体低氧时EPO水平反馈性升高以维持体内氧含量[7]。本研究发现，MM患者血清EPO水平高于正常对照组，且EPO水平与Hb水平呈显著的负相关，这表明MM患者贫血发生时，机体受到低氧的刺激，反馈性调节肾间质细胞分泌大量的EPO来维持Hb水平。研究发现，Ⅱ期患者EPO水平高于Ⅰ期和Ⅲ期患者，在Ⅲ期Hb水平低于Ⅱ期的前提下，Ⅱ期EPO水平反而高于Ⅲ期，这说明MM患者贫血时，EPO水平不仅受到贫血引起的细胞低氧的负反馈调节，还可能与其他因素相关，导致Ⅲ期患者体内EPO的分泌相对减少。进一步研究发现，肾功能无损害组患者血清EPO水平高于肾功能损害组及正常对照组，这一结果恰恰说明了肾功能损害对EPO水平的影响以及在MM患者贫血中的作用：肾功能受损使EPO反馈性升高受限，EPO分泌量相对不足，导致MM患者贫血进一步加重。Beguin等[8]的研究与本文的观点相似，MM患者EPO水平整体高于正常对照，该研究还进一步分析了纳入研究的62例MM患者血清EPO水平与正常对照的差异，结果显示约25%的患者血清EPO水平较正常对照组低，且EPO水平与疾病分期及肾功能损害程度密切相关，在Ⅲ期患者中这一比率上升至50%，而在伴有肾功能损害的患者中高达60%。这说明MM患者血清EPO水平整体升高，但部分患者尤其是D-SⅢ期及肾功能明显受损的患者，其血清EPO甚至低于正常对照组，这也印证了MM贫血患者EPO分泌量的相对性不足。

本研究还分析了与ACD的发生密切相关的细胞因子IL-6、TNF-α及IL-1β的水平，结果显示，实验组IL-6、TNF-α及IL-1β水平均高于对照组，实验组Hb水平分别与IL-6、TNF-α及IL-1β水平呈负相关，表明MM患者体内这些细胞因子分泌增多，且这些细胞因子可能有抑制红细胞生成，促进贫血发生的作用。IL-6是促进B细胞分化为浆细胞的主要细胞因子，研究表明，MM患者体内IL-6水平普遍升高[9]。在细胞实验与动物实验中发现，IL-6在体内外均有促进骨髓瘤细胞自发性增殖的作用[9-10]，表明IL-6也是骨髓瘤细胞生长的主要刺激因子。在本研究中，IL-6在MM患者血清中的水平升高，尤其是Ⅲ期患者IL-6水平高于Ⅰ期与Ⅱ期，表明IL-6与MM疾病的进展密切相关。Nemeth等[11]通过研究发现MM患者体内高水平的IL-6可刺激肝脏细胞产生过量铁调素(hepcidin)，hepcidin在十二直肠上皮细胞及巨噬细胞中结合铁蛋白并诱导铁蛋白降解，从而抑制肠道铁的吸收和巨噬细胞循环铁的释放，有效地减少了铁向成熟红细胞的输送，最终导致或加剧贫血的发生。Ratajczak等[12]发现，IL-6还可以通过直接抑制早期红细胞爆裂型集落生成单位(burst-forming unit-erythroid，BFU-E)的生长干扰红细胞的生成，而对CFE-U及晚期BFU-E没有明显的抑制作用。TNF-α是临床常见的炎症因子，Mehtap等[13]检测44例新诊断的MM患者血清细胞因子水平发现，初诊的MM患者血清TNF-α水平高于正常对照组，且D-S分期Ⅲ期患者血清TNF-α高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，这与本文的研究结果相似，表明TNF-α与MM疾病的发生和发展有着密切的关系。在关于MM患者贫血的研究中发现，TNF-α可通过直接抑制红细胞的生成和分化，降低机体对EPO的敏感性及促进MM细胞分泌IL-6等途径促进MM患者贫血的发生[2]。目前为止，国内关于IL-1β在MM中的作用的研究较少，国外的一些研究结果显示，MM患者体内IL-1β的分泌也是升高的，且IL-1β在体内和体外均有抑制红细胞生成的作用，进一步研究发现，IL-1β在MM患者贫血的病理生理机制中的作用类似于TNF-α，可通过促进骨髓瘤细胞及基质细胞分泌IL-6，直接抑制CFU-E及EPO生成，影响红细胞的生成[14]。在本研究中，MM患者IL-1β的水平高于对正常对照组，实验组IL-1β水平呈递增趋势，但Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅱ期与Ⅲ期的差异无统计学意义，只有Ⅰ期与Ⅲ期的差异有统计学意义，这与预期实验结果有一定差异，可能是由于本实验样本量较小导致的。总之，MM患者血清IL-6、TNF-α及IL-1β水平分泌增加，这些细胞因子不仅与MM的疾病进展密切相关，还可以通过抑制早期造血细胞，干扰铁代谢及抑制EPO分泌或降低其敏感性等方式影响红细胞的生成。

综上所述，MM患者血清EPO水平升高但其分泌量仍相对不足，血清IL-6、TNF-α及IL-1β水平升高可能与贫血的加重有关，临床可通过检测EPO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平作为评估MM患者病情和治疗贫血的参考。