增龄对人体外周血CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞、CD4+T细胞及细胞因子表达的影响

杨翔 罗杰 万文辉 李翰卿 贡歌 张瑗 陈阳希 刘瑜 张兴虎

随着增龄，机体的免疫功能明显减退，其主要原因就是免疫细胞的数量及功能下降，减弱了机体的抵抗力，从而导致老年人感染性疾病及肿瘤的发病率明显增加[1]。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)是一组具有免疫抑制功能的T细胞亚群，是机体维持自身耐受的重要成分。当机体出现衰老时,Treg细胞的表达和功能会发生变化，这种质和量的改变可能与老年人多种疾病的发生和发展有着密切的关系[2]。目前国内外涉及老年人外周血Treg的研究不多，而涉及高龄老年人的此类研究几乎没有。细胞衰老的另一个关键特征之一是细胞因子水平的改变。本研究主要观察青年人、中老年人及高龄老年人外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞和CD4+T细胞的绝对计数，并计算前者占后者的百分比，同时观察3组人群外周血IL-2、干扰素-γ(IFN-γ)、TNF-α、IL-10和IL-17水平的差异，以进一步研究增龄对免疫衰老及衰老微环境的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机抽取2018～2019年门诊或住院体检者，按年龄分为3组,每组40例。≥80岁为高龄老年组，平均(90.4±8.1)岁，其中男23例，女17例；年龄50～75岁为中老年组，平均(64.1±9.8)岁，其中男25例，女15例；年龄20～45岁为青年组，平均(37.9±8.2)岁，其中男24例，女16例。排除肿瘤、糖尿病、急慢性感染、自身免疫性疾病、服用免疫抑制剂或免疫增强剂治疗的病人。

1.2 主要仪器及试剂 CD4-FITC/CD25-APC/Foxp3-PE检测试剂盒(FITC标记的抗人CD4、APC标记的抗人CD25及PE标记的抗人Foxp3)购自美国 Ebioscience公司，所用流式细胞仪及数据分析软件为德国美天旎公司MACS Quant Analyzer。细胞因子检测试剂盒购自青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司，所用流式细胞仪及数据分析软件为Beckman公司生产的Navios。

1.3 检测方法

1.3.1 外周血CD4+T和 CD4+CD25+Foxp3+Treg的检测：样本管和对照管分别加入细胞表面标记抗体CD4-FITC/CD25-APC 10μL，涡旋混匀后避光孵育15 min； 每管内加入细胞核破膜剂(破膜剂棕瓶：破膜剂buffer白瓶=1∶3配置)，充分涡旋混匀，室温避光放置1 h。1500 r/min离心8 min，弃上清；加入2 mL的破膜buffer (破膜buffer原液∶蒸馏水=1∶9配置)，1500 r/min离心8 min，弃上清； 加入试剂盒中胎牛血清1μL避光孵育15 min(防止非特异性吸附)，随后样本管加入Foxp3-PE抗体10μL，对照管加入10μL Mouse IgG1-PE 作为同型对照，轻轻涡旋混匀，室温避光放置1 h；加入2 mL的破膜buffer，1500 r/min离心8 min，弃上清；加入450μL PBS重悬细胞，上机检测。

1.3.2 外周血 IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-7水平的检测：向标准品管中加入25μL基质B和25μL校准液，向样本管中加入25μL实验缓冲液和25μL样本；向所有管中加入25μL捕获微球抗体(按2∶1充分混合均匀)，再加入25μL检测抗体，室温(25±1℃)避光震荡孵育2 h(400～500 r/min)；向所有管中加入25μL藻红蛋白标记的链酶亲和素 (SA-PE)，室温(25±1℃)避光震荡孵育0.5 h(400～500 r/min)；向每管中加入500μL洗涤缓冲液，涡旋5 s，300～500 r/min离心5 min，缓慢倾倒出液体，倒扣于吸水纸上；根据流式细胞仪上样需求，向每管中加入150～300μL洗涤缓冲液，涡旋10 s将微球重悬，立即上机检测。

2 结果

2.1 3组外周血CD4+T细胞和 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞绝对计数及后者占CD4+T细胞百分比比较 本研究发现，中老年组外周血CD4+T细胞绝对计数和青年组相比无明显变化(P>0.05)，而高龄老年组CD4+T细胞绝对计数与前两组相比明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；高龄老年组和中老年组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞绝对计数均明显高于青年组(P<0.05)，而高龄老年组和中老组比较差异无统计学意义(P>0.05)；中老年组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞百分比明显高于青年组，高龄老年组明显高于中老年组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组CD4+T细胞和 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞绝对计数及后者占CD4+T细胞百分比

2.2 3组外周血IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-17水平比较 本研究发现，高龄老年组IL-2、IFN-γ和IL-17水平明显低于青年组和中老年组(P<0.05)；中老年组IL-2水平明显低于青年组(P<0.05)；高龄老年组IL-10水平明显高于青年组和中老年组(P<0.05)，3组 TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)；青年组和中老年组IFN-γ、IL-10和IL-17水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 3组外周血IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-7水平的比较

3 讨论

人口老龄化已是一个发展趋势，随着增龄，机体一个明显的特点就是免疫功能衰退，最突出的表现是T细胞数量减少、增殖能力下降，细胞介导的免疫应答反应迟缓及功能低下[3]。这种状况现正日益受到人们的重视，也是目前免疫领域的一个研究热点。

有研究表明，老年人外周血CD3+、CD4+T细胞水平均有明显降低，CD4+/CD8+比例降低[4]，T细胞不能有效识别抗原，不能有效清除病原体[5]。Treg细胞是机体维持自身耐受的重要成分，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞来源于胸腺，人和小鼠的Treg细胞可以抑制效应T细胞的增殖，减弱其活化并降低细胞因子的分泌，从而影响机体的免疫应答，产生免疫抑制作用[2,6-7]。

体内组织微环境中Treg细胞亚群功能的稳定性及其调控是当今免疫学领域的研究热点[8]，关于Treg细胞与年龄相关的免疫应答下降相关的研究结论尚未达成一致[9]。目前国内外针对高龄老年人Treg的研究基本没有。本研究把青年人、中老年人和高龄老年人作为观察对象，研究人体外周血CD4+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的表达以及IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-17水平的变化与增龄的关系。结果提示，高龄老年人外周血CD4+T细胞绝对计数较青年人和中老年人有明显下降，高龄老年人和中老年人外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞绝对计数均明显高于青年人，随着增龄，人体外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞百分比逐渐增高。说明随着增龄，T细胞免疫功能进一步下降，机体内Treg细胞已打破与其他T细胞间的平衡。到目前为止，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞随着增龄增多的原因还不十分清楚，有研究者认为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增龄性增多的原因可能与人体内转化生长因子β堆积有关，因为转化生长因子β可以诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+T细胞，而CD4+CD25+T细胞可以高表达Treg细胞的表面分子Foxp3，同时还能够抑制淋巴细胞分化增殖[10]。

细胞衰老的关键特征之一是细胞促炎因子和趋化因子等分泌的改变[11]。CD4+T细胞主要分为Th1和Th2两类亚群，Th1细胞分泌IL-2、IL-17和IFN-γ等细胞因子，IL-2主要发挥促炎和刺激T细胞增殖的作用。IL-17能诱导上皮细胞、内皮细胞和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达。IFN-γ通过上调内皮细胞黏附因子的表达，促进T细胞和IL-2R表达[12]。Th2细胞分泌IL-10和IL-6等细胞因子。本研究发现，高龄老年组IL-2、IFN-γ和IL-17水平明显低于青年组和中老年组，中老年组IL-2水平明显低于青年组。IL-10可抑制CD4+T细胞的增殖和细胞因子分泌，包括Th1细胞产生IL-2和IFN-γ，但不能抑制IL-17细胞生成IL-17，IL-10表达过多时也会诱发人体某些疾病[13]。本研究发现高龄老年组IL-10水平明显高于青年组和中老年组。以上观察结果与文献报道基本一致，进一步证实随着增龄人体免疫功能有进一步下降趋势。TNF-α由巨噬细胞和单核细胞产生，主要刺激机体炎症反应，也是导致动脉内皮功能紊乱和内膜增生的重要因素之一。有文献报道感染、心脑血管疾病及糖尿病等病人体内TNF-α水平是增高的[14-15]，但本研究发现健康高龄老年人TNF-α水平与青年组和中老年组并没有明显差异。

CD4+T细胞及Treg细胞的质和量的变化与许多疾病的发病机制有着密切的关系，随着增龄，机体内Treg细胞数量增多，打破与其他T细胞间的平衡，引起老年个体免疫应答能力的下降，从而可能出现对新抗原产生“免疫耐受”，导致易患感染性疾病和肿瘤等疾病，包括多种细胞因子在内的老化的免疫微环境可能对肿瘤的进展产生巨大影响[16]。研究CD4+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞和衰老微环境的变化与增龄的关系，可以在一定程度上揭示机体免疫衰老的机理，但具体的机制还有待于大样本的研究进一步探讨。