河南浓香型酒醅的真菌微生物菌群多样性及共变性

陈慧颖，李慧星，许 彬，曹 斌，王春艳,3

1. 西北民族大学生命科学与工程学院， 甘肃 兰州 730030；2. 南阳理工学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004；3. 南阳理工学院生物与化学工程学院， 河南 南阳 473004

白酒是世界六大蒸馏酒之一[1]。白酒品质受到酿造微生物菌群的显著影响[2]，其中酒醅微生物菌群来自于酒曲、窖泥以及生产环境，还受到工艺条件和参数等多因素的影响，菌群多样性和变化规律更加复杂[3]。酒醅中有大量的酵母、霉菌等真菌微生物，它们对大分子物质降解有重要作用，代谢产物是酒体风味与口感形成的重要物质基础[4-8]。

高通量测序技术具有高通量、高分辨率的优势，为准确揭示微生物菌群的多样性提供了强有力的手段[9,10]。Miseq是Illumina开发的第二代高通量测序技术，具有成本低、准确率高、操作简便的优点[11-13]，已被成功应用于不同香型白酒酒醅的微生物真菌菌群分析[14-20]。刘凡[14]等研究表明洋河浓香型酒醅发酵过程中真菌属水平共鉴定出134 个属，其中嗜热真菌属Thermomyces、热子囊菌属Thermoascus和根毛霉属Rhizomucor在窖内发酵整个阶段均为优势菌属。与主要有机酸合成相关的真菌有酵母属Saccharomyces、Naumovozyma、伊萨酵母属Issatchenkia和根霉属Rhizopus。胡晓龙[15]等以贾湖浓香型酒醅为研究对象，高通量测序技术检测到厚壁菌门Firmicutes是菌群优势菌门。贾丽艳[16]等通过高通量测序技术研究了清香型白酒大楂和二楂发酵过程中的真菌菌群，发现子囊菌纲的腹膜孢酵母属、酵母属、假丝酵母属、有孢汉逊酵母属和有孢圆酵母属为优势菌群。卫春会[17]等通过高通量测序表明汾酒酒醅大楂、二楂的发酵初始真菌群落相似，主要的优势菌都是毕赤酵母Pichia，发酵后期优势菌有较大差异，大楂酒醅最主要的优势菌为酿酒酵母Saccharomyces，二楂酒醅最主要优势菌为假丝酵母Candida。陈雪[18]等利用高通量测序技术分析凤香型白酒酒醅，发酵过程中共检测出33个真菌属，以Naumovozyma、根霉属Rhizopus、热子囊菌属Thermoascus、曲霉属Aspergillus、假丝酵母属Candida为主，其中Naumovozyma占绝对优势。郝飞[19]等采用高通量测序法分析得到酱香型白酒酒醅中优势酵母菌属有毕赤酵母属Pichia、拜耳接合酵母属Zygosaccharomyces、酿酒酵母属Saccharomyces和假丝酵母属Candida。

不同香型白酒酒醅的微生物菌群有差异性，相同香型不同来源的白酒酒醅的多样性和演替规律也有明显差异。然而，当前研究多集中于某个酒厂酒醅发酵过程的微生物菌群演替规律[21-24]、空间异质[5,15]、菌群与风味物质的关联[25,26]，而对酒醅微生物菌群的共性变化规律研究较少。浓香型白酒是白酒的最重要香型之一，产销量约占白酒总量的70%[27,28]。实验取样于河南三个不同浓香型白酒厂的酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)，采用的Illumina MiSeq高通量测序技术分别研究入窖酒醅和出窖酒醅的真菌微生物菌群，依次在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)和属(genus)5个水平上进行分析，一方面展示河南浓香型白酒入窖酒醅和出窖酒醅的真菌微生物多样性；另一方面，分析三个不同酒厂的酒醅发酵后真菌菌群的共性变化规律，为探究酒醅发酵的功能微生物，改造酒醅微生物菌群提高白酒品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

浓香型酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)样品分别取自于河南南阳社旗、濮阳南乐和周口鹿邑的三个白酒厂，入窖酒醅分别命名为EFG-1，EFG-2，EFG-3，出窖酒醅分别命名为OFG-1，OFG-2，OFG-3，样品采集后密封、保存于4℃。E.Z.N.A.Soil DNA Kit，Qubit2.0 DNA检测试剂盒，Taq DNA Polymerase，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。

入窖酒醅和出窖酒醅的理化指标见表1。

表1 入窖酒醅和出窖酒醅的理化指标

1.2 实验方法

实验方法和数据分析参考文献[13]。PCR扩增真菌的ITS序列，采用Miseq测序平台的通用引物，ITS1引物：5′CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode) CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3′，ITS2-Rev引物：5′GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGA-GAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC3′。

2 结果与分析

2.1 测序序列数目和多样性指数分析

浓香型酒醅样品经高通量测序和质量控制后，获得有效序列。根据差异水平在0.03(即相似度97%)的水平上聚类得到操作分类单元(OTU)。由表2可以看出：样品测序的覆盖率均大于98%，表明测序结果代表样品的真实情况。三个入窖酒醅样品(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的有效序列数量分别是38933、52416和62533，聚类得到OTU数目分别为1173、910和609；三个出窖酒醅样品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的有效序列数量分别是53699、54776和23816，聚类得到OTU数目分别为1517、1583和1010。在序列聚类获得OTU的基础上，分别采用Shannon指数和Chao1指数描述菌群物种的多样性，其中Shannon指数和Chao1指数越大，说明群落多样性越高。EFG-1、EFG-2和EFG-3的Shannon指数和Chao1指数分别低于OFG-1、OFG-2和OFG-3的Shannon指数和Chao1指数，说明入窖酒醅的真菌菌群多样性低于出窖酒醅的真菌菌群多样性。浓香型酒醅经过发酵后真菌菌群发生变化，物种多样性提高。这是由于入窖酒醅的微生物主要来自生产环境和酒曲，而出窖酒醅的微生物来源是生产环境、酒曲和窖泥。

表2 OTU数量及多样性指数

实验依次在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)和属(genus)5个分类水平上进行分析，通过酒醅样品的真菌菌群分布和变化趋势来阐释酒醅中真菌菌群的多样性和共变性。为了使真菌菌群分布的显示效果较好，实验选取相对丰度较大的前15个物种(不足15个的则选取所有物种)，将相对丰度较低的部分合并为Other显示在图上。真菌菌群变化趋势是在真菌菌群分布的基础上，将三个入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和三个出窖酒醅样品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)分别进行比较，分析出三个不同来源浓香型酒醅发酵后具有相同和显著变化趋势的真菌物种。

图1 在门水平上浓香型酒醅的真菌菌群

2.2 在门(Phylum)水平上浓香型酒醅的真菌菌群

图1为在门(Phylum)水平上浓香型酒醅的真菌菌群，可以看出：三个入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的优势菌群均是子囊菌门Ascomycota，它的相对丰度为80%～90%。除子囊菌门Ascomycota以外，酒醅中还有一定量的未分类真菌、接合菌门Zygomycota和担子菌门Basidiomycota。分别比较入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，可知出窖酒醅中担子菌门Basidiomycota的相对丰度均高于入窖酒醅中担子菌门Basidiomycota的相对丰度(图2)，浓香型酒醅发酵后担子菌门Basidiomycota的相对丰度增加。

图2 浓香型酒醅中担子菌门的变化趋势

2.3 在纲(Class)水平上浓香型酒醅的真菌菌群

在纲(Class)水平上浓香型酒醅的真菌菌群如图3所示，入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的优势菌群有酵母纲Saccharomycetes和散囊菌纲Eurotiomycetes，它们的相对丰度分别是31%～65%和14%～44%。出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的优势菌群是粪壳菌纲Sordariomycete(相对丰度30%～55%)，还有一定量的座囊菌纲Dothideomycetes(相对丰度3%～5%)、锤舌菌纲Leotiomycetes(相对丰度8%～15%)、银耳纲Tremellomycetes，(相对丰度2%～5%)、酵母纲Saccharomycetes(相对丰度2%～32%)和散囊菌纲Eurotiomycetes(相对丰度3%～16%)。

分别比较入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，图4显示了在纲水平上浓香型酒醅中真菌的变化趋势。酒醅发酵后，粪壳菌纲Sordariomycete、锤舌菌纲Leotiomycetes、座囊菌纲Dothideomycetes和银耳纲Tremellomycetes的相对丰度均有增加，其中粪壳菌纲Sordariomycete和锤舌菌纲Leotiomycetes的相对丰度增加幅度较大。酵母纲Saccharomycetes和散囊菌纲Eurotiomycetes的相对丰度明显降低。

图3 在纲水平上浓香型酒醅的真菌菌群

2.4 在目(Order)水平上分析浓香型酒醅的真菌菌群

在目(Order)水平上浓香型酒醅的真菌菌群如图5所示，入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的优势菌群有酵母目Saccharomycetales和散囊菌目Eurotiales，它们的相对丰度分别是31%～65%和13%～34%。出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的优势菌群是肉座菌目Hypocreales，相对丰度18%～34%；还有一定量的银耳目Tremellales(相对丰度2%～4%)、格孢腔菌目Pleosporales(相对丰度2.7%～4%)、酵母目Saccharomycetales(相对丰度2%～32%)和散囊菌目Eurotiales(相对丰度3%～16%)。此外，还有大量未分类和未定地位的真菌，如unclassified-Leotiomycetes等。

分别比较入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，图6显示了在目水平上浓香型酒醅的真菌变化趋势，酒醅发酵后肉座菌目(Hypocreales)、格孢腔菌目(Pleosporales)和银耳目(Tremellales)的相对丰度均有增加，而酵母目(Saccharomycetales)和散囊菌目(Eurotiales)的相对丰度均有降低。

图5 在目水平上浓香型酒醅的真菌菌群

2.5 在科(Family)水平上分析浓香型酒醅的真菌菌群

在科(Family)水平上浓香型酒醅的真菌菌群如图7所示，入窖酒醅(EFG-1、EFG-2)的优势菌有发菌科Trichocomaceae(相对丰度24%～34%)和Pichiaceae科(相对丰度28%～56%)，入窖酒醅EFG-3的优势菌是发菌科Trichocomaceae(相对丰度12.6%)和复膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae(相对丰度58.8%)。出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的优势菌群是Plectosphaerellaceae科(相对丰度10%～20%)和丛赤壳科Nectriaceae(相对丰度18%～33%)。还有一定量的孢腔菌科Pleosporaceae(相对丰度2.5%～4%)、发菌科Trichocomaceae(相对丰度2.5%～16%)和Pichiaceae科(相对丰度1%～16%)等。此外，还有大量未分类的真菌，如Unclassified-Tremellales等。

分别比较入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，图8显示了在科水平上浓香型酒醅中真菌的变化趋势，可以看出酒醅发酵后丛赤壳科Nectriaceae、Plectosphaerellaceae科和孢腔菌科Pleosporaceae的相对丰度均有增加，发菌科Trichocomaceae的相对丰度降低。OFG-1和OFG-2相比较于EFG-1和EFG-2，Pichiaceae科的相对丰度降低，而复膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae的相对丰度变化不明显；OFG-3相比较于EFG-3，复膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae的相对丰度降低，而Pichiaceae科的相对丰度变化不明显。

图7 在科水平上浓香型酒醅的真菌菌群

图8 在科水平上浓香型酒醅中真菌变化趋势

2.6 在属(Genus)水平上分析浓香型酒醅的真菌菌群

在属(Genus)水平上浓香型酒醅的真菌菌群如图9所示，入窖酒醅(EFG-1、EFG-2)的优势菌是伊萨酵母属Issatchenkia(相对丰度27%～57%)，一定量的复膜孢酵母属Saccharomycopsis(相对丰度1.8%～3.6%)和大量的未分类真菌。入窖酒醅EFG-3的优势菌是复膜孢酵母属Saccharomycopsis(相对丰度58.8%)。出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的优势菌群是镰刀菌属Fusarium(相对丰度17%～32%)和Plectosphaerella属(相对丰度10%～19%)。还有一定量的链格孢属Alternaria(相对丰度2.5%～3.7%)和大量的未分类真菌。

分别比较入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的菌群分布，图10显示了在属水平上浓香型酒醅中真菌的变化趋势，酒醅发酵后镰刀菌属Fusarium、Plectosphaerel-la属和链格孢属Alternaria的相对丰度均有增加。OFG-1和OFG-2相比较于EFG-1和EFG-2，伊萨酵母属Issatchenkia的相对丰度降低，而复膜孢酵母属Saccharomycopsis的相对丰度变化不明显；OFG-3相比较于EFG-3，复膜孢酵母属Saccharomycopsis的相对丰度降低，而伊萨酵母属Issatchenkia的相对丰度变化不明显。

图9 在属水平上浓香型酒醅的真菌菌群

图10 在属水平上浓香型酒醅中真菌变化趋势

3 结论

基于Illumina MiSeq高通量测序展示了河南浓香型酒醅的真菌微生物多样性，出窖酒醅的真菌微生物多样性高于入窖酒醅的真菌微生物多样性，出窖酒醅中真菌微生物有子囊菌门Ascomycota、粪壳菌纲Sordariomycete、肉座菌目Hypocreales、丛赤壳科Nectriaceae、镰刀菌属Fusarium；子囊菌门Ascomycota、粪壳菌纲Sordariomycete、Plectosphaerellaceae科、Plectosphaerella属；子囊菌门Ascomycota、座囊菌纲Dothideomycetes、格孢腔菌目Pleosporales、孢腔菌科Pleosporaceae、链格孢属Alternaria等。入窖酒醅中真菌微生物有子囊菌门Ascomycota、酵母纲Saccharomycetes、酵母目Saccharomycetale、Plectosphaerellaceae科、伊萨酵母属Issatchenkia；子囊菌门Ascomycota、酵母纲Saccharomycetes、酵母目Saccharomycetale，复膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae，复膜孢酵母属Saccharomycopsis；子囊菌门Ascomycota、散囊菌纲Eurotiomycetes、散囊菌目Eurotiales、发菌科Trichocomaceae等。

在浓香型酒醅真菌微生物多样性的研究基础上，分别比较三个不同酒厂的酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)的真菌微生物菌群，探究酒醅发酵后的菌群共性变化规律，结果如图11所示。浓香型酒醅发酵后子囊菌门Ascomycota的相对丰度稳定，担子菌门Basidiomycota的相对丰度增加。子囊菌门Ascomycota的相对丰度稳定，是由于子囊菌门Ascomycota中粪壳菌纲Sordariomycete、肉座菌目Hypocreales、丛赤壳科Nectriaceae、镰刀菌属Fusarium的相对丰度增加；座囊菌纲Dothideomycetes、格孢腔菌目Pleosporales、孢腔菌科Pleosporaceae，链格孢属Alternaria的相对丰度增加；锤舌菌纲Leotiomycetes的相对丰度增加。另一方面，酵母纲Saccharomycetes、酵母目Saccharomycetale，Plectosphaerellaceae科，伊萨酵母属Issatchenkia的相对丰度降低，或酵母纲Saccharomycetes、酵母目Saccharomycetale，复膜孢酵母科Saccharomycopsidaceae，复膜孢酵母属Saccharomycop-

图11 浓香型酒醅发酵后真菌菌群的变化规律

sis的相对丰度降低；散囊菌纲Eurotiomycetes、散囊菌目Eurotiales、发菌科Trichocomaceae的相对丰度降低。担子菌门Basidiomycota的相对丰度增加主要是银耳纲Tremellomycetes，银耳目Tremellales的相对丰度增加。然而，酒醅的真菌微生物菌群在门、纲、目、科、属5个分类水平上逐次分析，真菌物种变化规律无法完全可循，如锤舌菌纲Leotiomycetes、银耳目Tremellales、发菌科Trichocomaceae的变化，这是由于分类水平越高，种类越多，相对丰度较低的物种变化趋势不明显；另一方面，随着分类水平的提高，样品中出现了大量未分类和未定地位的真菌。