纤维素降解菌的研究与应用进展

章沙沙，徐健峰，柳增善*

1.吉林大学 人兽共患病研究所教育部重点实验室/动物医学学院，长春 130062；2.盘锦检验检测中心/盘锦市疾病预防控制中心,盘锦 124010

近年来，全球的环境污染和能源危机威胁着人类的可持续发展，同时也刺激了社会对可再生资源的利用需求[1]。我国提出到2025年，利用可再生资源实现规模化生产生物乙醇，争取达到国际领先技术水平。纤维素降解菌分泌的纤维素酶在世界工业酶市场居第三位，占工业酶需求总量的8%～10%，预计纤维素酶每年销售量近4-5亿美元[2]。美国诺维信公司是最早研发生产纤维素酶制剂的公司，从2009年—2012年连续三年推出复合纤维素酶Cellic CTec1代、2代、3代。与此同时，美国杜邦公司推出首款纤维素转化商用酶Accellerase1000，之后又陆续推出1500、DUET、TRIO等Accellerase系列产品[3]。纤维素酶在食品、纺织品、动物饲料、生物燃料、清洁产品、造纸业等其他市场有普遍应用。本文针对纤维素降解菌的种类及在工农业生产中的实际应用进行了论述，为进一步探索纤维素降解菌未来研究方向作了展望。

1 纤维素降解菌的研究进展

在自然环境中，许多微生物都能够降解纤维素。已发现的能够有效降解纤维素的微生物种类有200种以上，其来源非常广泛，在反刍动物胃肠道和某些昆虫体内也能分离到纤维素降解菌。表1为目前已知能产生纤维素降解作用的主要菌株，分为三大类：细菌、真菌、放线菌，其中以真菌种类居多，且应用最为广泛。

1.1 纤维素降解菌

1.1.1真菌

真菌降解纤维素的能力强、产酶量大，是研究最深入的纤维素降解菌。木霉属、曲霉属和青霉属是纤维素酶工业化生产的主要酶源，目前工业级水解酶活性较高的代表菌种为里氏木霉、康氏木霉和黑曲霉[4]。地霉菌和烟曲霉是堆肥底物中的主要菌群，橙色嗜热子囊菌、担子菌等也具有较强的分解纤维素的能力。刘清锋等[5]从秸秆中分离到1株分解纤维素能力较强的青霉菌T24-2。测定最佳CMC酶活为45.01 IU/mL和滤纸酶活为6.89 IU/mL。T24-2降解稻草粉后糖化率可达40.17%，说明该菌在秸秆利用上具有良好的应用前景。智利科学家CARRASCO M[6]等人从南极亚地区的土壤样品中分离出22种耐寒酵母，在较宽的温度范围(4 ℃～30 ℃)中检测到不同程度的纤维素。ATHIRARAJ S R[7]等人利用金丝桔梗通过微紫青霉菌NCIM1366替代里氏木霉生产生物乙醇。NCIM1366所产β-葡萄糖苷酶活高出里氏木霉近十倍，同时NCIM1366向细胞外培养基分泌更多的蛋白质，浓度比里氏木霉高1.8倍酶活性。孙芹英等[8]将白腐菌混合发酵用于降解秸秆，为秸秆类废物资源提供了新的途径。JAIN L[9]通过甘蔗渣糖化与Alaromycesverruculosus(一种海洋真菌)IIPC324固态发酵生产纤维素酶，通过优化发酵条件将其应用于生产生物燃料。曹慧[10]等从青藏高原土壤中筛选出低温纤维素降解菌株钉斑链霉菌LD19，LD19可同时分泌半纤维素酶和低温纤维素酶，在饲用工业中具有较大应用潜力。

表1 纤维素降解菌种类及应用领域

1.1.2细菌

在自然界中，真菌通常比细菌产生更多的纤维素酶，但由于真菌所产酶大多为耐酸纤维素酶，在某些工业化条件下制约了其生产。此外，与真菌相比，细菌生长快速，容易获得较高的酶产量，因此在生产应用上就具有较高现实意义。细菌所产纤维素酶一般为细胞表面酶，分解纤维素时细菌附着在纤维素表面，向内部增生，在接触点处纤维素被细菌破坏后溶解[11]。PRAMANIK S K[12]等将假蕈状芽孢杆菌与甘蔗渣为原料共同发酵用于生产纤维素酶，并分析了所产纤维素酶的蛋白质结构，为进一步探索芽孢杆菌中纤维素酶和纤维素相互作用的动力学提供依据。蔡兴旺等[13]和孔雅丽等[14]分别从堆肥和土壤中分离筛选出纤维素酶高产菌株，纤维单孢菌D1和芽孢杆菌X3-2，并同时研究了最适产酶条件。刘占英等[15]从反刍动物体内中筛选出4株细菌，纤维素降解率均能达到20%以上。ZHANG Z Y[16]等人从甲虫的肠道中分离出韦氏芽孢杆菌ZY-1-1，对其基因组的完整分析发现在预测的3688个蛋白质编码基因中有24个基因参与纤维素的降解，这将有助于纤维素生物降解的机理以及新型纤维素分解细菌的生物技术应用。日本研究学者YUYA T[17]分别比较了3种纤维单胞菌(粪氏、重氮和产黄)对纤维素的降解效果，发现粪氏纤维单胞菌降解效果最好，4 d内可降解2.5 g/L的纤维素，研究结果表明该菌是新型微生物燃料电池的极佳候选者。本实验室中从反刍动物的血液、肠道和粪便中分离得到6株纤维素酶活较高的细菌，经鉴定分别为1株纤维单胞菌属和5株纤维微细菌属，并将其用于环保领域(降解废水污水)和生物医疗领域(转化稀有人参皂苷)的研究，均取得了一定进展[18]。

1.1.3放线菌

研究表明，放线菌是一类蕴含巨大实用价值的微生物，并且大多数放线菌在高温和强碱性条件下仍能保持较高活性，可以产生大量的生物酶，可以添加到饲料中抑制肠道内有害菌的生长，还可以降低饲料中的抗营养因子，提高饲料的利用率[19]。用放线菌制成的微生物发酵菌剂具有极好的应用价值，如 CHELLAPANDIP[20]等从花园土壤中分离出的26种链霉菌，其中巴西链霉菌的天然菌株在深层发酵中生产高产量的内切葡聚糖酶，被认为在食品和纺织工业中有效利用的候选菌株。魏越波[19]获得一株耐高温产酶放线菌嗜热链球菌Fx-1, Fx-1可耐60 ℃的高温, 当pH为7.0，含水量为40%的物料中培养为最适生长条件，该菌株可为筛选发酵饲料耐高温菌株提供优质的菌种资源。WANG C[21]等人从堆肥放线菌的16Spyrotag库发现的放线菌群拥有大约46.1%的纤维素酶基因，它们属于纤维二糖水解酶，β-葡萄糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木质素酶基因，这一研究结果有望应用于能源领域用于生产生物燃料。

1.2 纤维素降解菌基因工程菌的构建

通过基因组学技术以及代谢工程途径从各种纤维素降解菌中获得的新型纤维素酶基因的使用将在工业生产中提高高产纤维素酶来源。1982年WHITTLE D J[22]等人首次克隆出粪纤维担胞菌的纤维素酶基因，迄今为止，研究学者已从细菌和真菌中克隆并测序出80多种纤维素酶基因。LIU H[23]为了将纤维素生物质有效地转化为生物乙醇燃料，他们利用基因工程技术改造了几株酵母菌，进行基因修饰后表达了重组纤维素酶。SONG Y H等人[24]用黑山羊瘤胃构建嗜热纤维素酶的宏基因组文库，发现GH74的KG37基因与两个琥珀酸纤维杆菌内切1,4-β-葡聚糖酶有77%的相似性。在大肠杆菌中过表达后重组纤维素酶在高达50 ℃的温度下表现出活性和热稳定性，可用于将纤维素转化为工业产品。HEGAZY W K[25]构建一种有效降解纤维素的新型重组菌株。从枯草芽孢杆菌BTN7A菌株中克隆了内切葡聚糖酶基因(bgls)，将获得重组质粒转化到大肠杆菌中成功高效表达该基因。新构建克隆株产酶率比原菌株高得多。LIU Z[26]成功的构建了纤维素啤酒酵母产纤维素酶工程菌，该菌不但可以直接用于从稻草中生产乙醇，同时酶用量减少了40%，使生产纤维素生物燃料的可行性大大提高。由于真菌产生的β-葡萄糖苷酶活性低，基因组中编码纤维素降解酶的基因数量较少，导致其酶系组成不够齐全。美国陆军军需研发中心将里氏木霉经诱导突变并改造遗传密码，开发出高活力纤维素酶基因工程菌株，酶系包含β-1,4-葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、半纤维素酶，现已成为美国几家酶制剂大公司应用最广泛的纤维素酶生产菌。

2 纤维素降解菌应用研究

2.1 农业领域

我国是一个农业大国，每年可产出数百万吨的农作物秸秆和纤维素废弃物，对农业废弃物的合理处理是环保领域亟待解决关键问题之一。纤维素作为一种广泛存在的可再生资源，如果能够转化为有用的资源，对于农业经济的发展有极大的价值。研究表明，纤维素降解菌可增强土壤降解秸秆的能力，木霉菌、白腐菌可降解几乎所有的木质纤维素，这对于农作物废弃物处理具有十分重要的意义[27]。如美国的杜邦公司出品的纤维素转化商用酶Accellerase TRIO就成功地应用于玉米秸秆、小麦秸秆和甘蔗渣等不同种类的木质纤维素原料[28]。LI J等[29]从藏牛瘤胃中分离和鉴定出2株纤维素分解细菌，木薯肠球菌JFL12和粪肠球JF85，将它们与植物乳杆菌共同处理青贮饲料，结果发现具有更高的葡萄糖产量和纤维素可转化性，可加速结构性碳水化合物的降解并改善青贮饲料的质量，可作为提高青贮饲料的发酵质量的候选菌株。ZHOU X L[30]等人分离出粘细菌LPMO10B分泌的胞外酶可降低农作物秸秆纤维素的聚合度，并与商业纤维素酶协同作用以促进糖化反应。用商业纤维素酶与ViLPMO10B以9∶1比例混合，玉米秸秆，甘蔗渣和稻草转化为还原糖的转化效率分别提高了17%，16%和22%,结果表明ViLPMO10B在农业残留物处理中具有应用价值。虽然有较多的菌种资源可以利用，但总体上降解效率较低，需要改造或优化条件，才能增加利用效率。

2.2 工业领域

2.2.1能源生产领域

2020年12月，中国发布《新时代的中国能源发展》白皮书中指出，中国能源生产和利用方式将发生重大变革，提倡与国际合作共同推进能源绿色转型。将农业生产的秸秆等纤维废弃物、工业生产过程中纤维废渣和生活工作中高纤维素类废纸物质通过纤维素降解菌变成生产乙醇的主要原料，成本低，利用率高，可以将再生的纤维素材料转化为生产乙醇[31]。美国Novozyme公司成功的将纤维素酶生产酒精的成本减低30倍，这一成果使得其与利用淀粉生产酒精的成本持平。同时成本的降低使燃料酒精的价格和汽油相差无几。另外在美国能源部的网站上也有关于玉米秸杆等纤维质资源的生产清洁燃料酒精的详细介绍。美国多家公司合作将玉米中的纤维素、木糖等物质全部转化成乙醇，产量更高，能耗更低，单位体积乙醇的投资成本更低，而且玉米油回收率提高50%[28]。根据国际《可再生能源2019》发展报告，中国将是生物质能生产最大的国家。在中国很多省份开展的10%乙醇混合燃料的使用以及不断增长的投资使得乙醇生产将实现3倍增长。美国燃料乙醇产量约占全球的43%，巴西约占32%，中国约占3%。利用玉米生产乙醇的成本为0.25 USD/L，利用甘蔗生产乙醇的成本为0.2 USD/L，利用纤维素生产乙醇的成本达到1.4 USD/L。美国和丹麦合作开发的以纤维素酶为主的REnescience技术，该技术应用纤维素酶等酶液化溶解城市垃圾，不但将废物转化为能源，同时不需要燃烧废物，将其处理成生物液体(用于生产沼气)和固体，使得长期以来难以处理的城市垃圾能够回收利用[32-33]。此外，纤维素酶还能提高产生物质气的产率，明显降低城市污水中的COD值。

2.2.2食品工业领域

在食品工业中纤维素酶应用范围较为广泛，在发酵面点类食品使用可以提高面包等制品的烘培品质和营养；在酱油酿造加入添加，可以加快发酵速度，改善酱油风味和质量；在茶叶加工中加入纤维素酶，可加快释放茶多糖，提高茶多酚的萃取率，具有较好的稳定性；在生产水果蔬菜罐头过程中加入纤维素酶，可控制保持果汁的颜色不被降解，提高加工果蔬汁的出汁率，并且改善果汁色泽和贮藏的稳定性。纤维素酶在加入烟草和人参生产中也发挥一定作用，可提高烟草品质和人参有效成分的提取率[34]。TANAKA[35]报道了从海洋中的野生黑鱼肠道中分离出新的纤维素降解细菌，经鉴定为微泡菌属GL-2，所产纤维素酶的水解产物是纤维二糖，可作为食品工业生产纤维二糖的潜在来源。LMJ C D等[36]利用芽孢杆菌分泌的嗜热纤维素酶来改善菠萝汁的提取澄清工艺。

2.2.3饲料工业领域

酸性纤维素酶在饲料加工行业中利用较为广泛，是目前研究的重点[37]。因畜禽饲料中含有大量的纤维素，纤维素酶作为饲料添加剂(添加量为0.1%～0.3%)，添加到饲料中可促进牲畜食欲,还可以增加和补充动物体内各种消化酶的含量，预防和治疗一些家畜常见胃肠道疾病[38,39]。在大麦和玉米中添加纤维素酶，可明显增加糖的总含量。在青贮饲料中加纤维素酶制剂，纤维素分解乳酸发酵，使得青贮饲料更佳柔软，口感更好，同时减低饲料的酸度[40]。在酒糟中添加纤维素降解菌不仅可以丰富饲料的来源，还能提高饲料的品质、改善酒糟在动物体内消化率低的问题，同时还能丰富动物体内的同源酶类，降低抗营养因子[41]。聂利波等[42]研究了枯草芽孢杆菌Kpg所产的纤维素酶，将其加入鸡饲料中，能够显著降低麸皮中的纤维素含量，明显提高鸡对粗纤维的消化率。

2.2.4纺织工业领域

纤维素酶被应用于纺织工业中用来减少布料的变色和起毛现象。纺织工业的退浆过程是从织物上除去淀粉，将纤维素酶随同上浆剂添加到纱线中，起到增强剂的作用，以防止织造过程中经纱断裂。纤维素酶用于降解亚麻纤维等极其细小的纤维，同时不破坏纤维内部结构的稳定性[43]。纤维素酶还可以用来制造牛仔裤的石洗外观。通常，嗜热纤维素酶用于代替石磨水洗牛仔裤，应用在靛蓝牛仔服装中，以获得相同染料脱色等效果。大多数棉混纺服装在反复洗涤过程中，由于表面存在部分分离的微纤维，往往会变得蓬松和无光泽。利用酸性纤维素酶催化降解纤维素等大分子，使织物变得光洁、手感柔软、并可防止起球，提高产品档次[44]。

2.2.5洗涤剂工业领域

随着我国对洗涤行业绿色化发展的要求，将生物酶技术应用于洗涤剂如洗衣凝珠生产中，纤维素酶通过穿越纺织物的纤维间空间而起作用，以改善织物的光滑度和去污能力，同时保持衣物的色泽和亮度[45]。洗涤制剂中通常使用碱性纤维素酶, 即减少了对人体有毒成分的洗涤剂的用量，同时也利于降低能源消耗和保护环境。杨媛等[46]采用羧甲基纤维素法检测洗衣凝珠中的纤维素酶，结果表明在市售洗衣凝珠中添加0.5%纤维素酶，由显微镜下观察国标污布JB-01去污渍能力效果更佳。

2.2.6造纸工业领域

在木质材料的机械制浆过程中，用纤维素酶制备的纸浆具有多种应用，包括节能，提高机械强度等。此外，纤维素酶还可以增强纸浆的可漂白性和不同类型纸废料的脱墨，减少了纸浆细颗粒，改进了纸的光纤维度[47]。将纤维素酶与木聚糖酶组合使用，可以用于制备可生物降解的纸板和制造纸巾、卫生纸等。

3 纤维素降解菌的未来趋势

现如今地球上的石油、矿产等非可再生资源即将耗竭的时代，我国相继推出有关开发新能源生物燃料的政策，以推动能源结构调整，自然界中大量的秸秆废料等天然纤维素作为潜在的生物能源可用于开发生产工业乙醇、燃料电池、动物饲料、洗涤用品等产品，具有极大的市场空间。生物降解纤维素具有环保、高效、经济等特点，高效利用纤维类物质则需要根据特定的要求来选取纤维素降解菌。首先，纤维素降解菌菌株的选育工作仍需加强，通过宏基因组学、原生质体融合、代谢组学等技术来获得超高酶活工程菌[48]。其次，纤维素降解酶的性能仍需挖掘和改进。通过蛋白质组学对纤维素降解菌进行工程设计，以增强纤维素酶水解效率和工业用酶产品的成本降低。最后，发酵工艺的建立、优化和放大是实现高效生产关键性的最后一公里[49]。通过开发重组生物和基因表达系统，建立高效的流加补料发酵等工艺，最大限度地挖掘高产菌株的产酶能力，以更好地生产纤维素酶以及生物燃料，用于工农业生产。以上几个方面的工作一旦取得突破性进展，必将使巨大的纤维素资源得以充分利用，纤维素生物化学品产业可持续发展[50]。