徕卡病理切片系统在动物病理诊断上的应用

沈红霞，倪柏锋，虞一聪，王 彬，周 炜，周芷锦，穆 琳

(浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 311199)

病理组织石蜡切片是进行病理诊断的一项基本实验技术，也是应用于动物疾病病理诊断的常见手段之一。传统病理切片制作方法从组织取材、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、摊片、烤片、染色和封片都为纯手工操作，其中染色环节就涉及十几个步骤。由于操作程序和环节繁多，制作一张质量优良的切片往往需要数日的时间，而且对制片操作人员技术要求较高。

随着现代生物医学研究和仪器自动化发展，全自动脱水机、切片机、染色机等自动化仪器被应用于病理组织切片制作各个环节，逐步实现病理切片制作的自动化，以满足各大医疗及科研机构日常大通量检测样品的场景需求。目前，市场上应用较多的病理设备生产厂家主要有德国徕卡(Leica)、德国美康、英国珊顿、日本樱花等[1]。自动化病理切片设备一般由软硬件组成，应用前需要较长时间的熟悉和条件摸索，但操作系统熟悉后具有制片效率高、切片质量稳定、设计环保、操作便捷等优点，还可以结合全切片图像扫描等技术实现数字化[2]，将为疾病诊断提供更精准的依据。本文将以猪肝病理切片制作为例，详细介绍Leica病理切片系统的软硬件操作方法及注意事项。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1组织材料 本实例使用的猪肝样本取自健康猪屠宰后的新鲜肝脏。

1.1.2试剂与耗材

1.1.2.1 试剂 福尔马林(上海凌峰，批号：20170925)，石蜡(国药集团，批号：20160919)，苏木素-伊红染色液(Baso，719033)，无水乙醇(上海凌峰，批号：20180301)，二甲苯(国药集团，批号：20160929)，中性树脂(上海标本模型厂，批号：20180703)；分化液(1%盐酸酒精)、1%稀氨水、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇均为本实验室配制。

1.1.2.2 耗材 一次性切片刀、包埋盒、载玻片、盖玻片。

1.1.3仪器 Leica ASP300S高级智能脱水机、Leica HistoCore Arcadia C/H石蜡包埋机、Leica RM2235转轮式切片机、Leica HI1210摊片机、Leica HI1220烘片机、Leica AutoStainerXL自动载玻片染色机(上海徕卡仪器有限公司)、摄影显微镜(蔡司)。

1.2方法

1.2.1实验操作流程 图1为操作流程。Leica病理切片系统为软硬件结合系统，应用自带的智能软件系统使传统手工操作中的脱水、浸蜡、透明、染色环节实现自动化，通过温度、压力、时间等参数的设定，为制片提供稳定的制作环境。此外，系统中包埋机、摊片机、烘片机的操作便捷，控制稳定，均让制片质量得到更高保障。

图1 Leica病理切片系统流程图示(部分图片来源于网络)

1.2.2固定 从动物体取下的新鲜组织，一旦离体尽快放入新鲜配置的10%福尔马林固定液中进行固定，防止组织发生自溶，保持组织原有的形态学结构。固定液的量应为标本体积的10～20倍，使固定液更均匀迅速地渗透组织内部，固定时间需根据组织块大小，大体脏器一般不少于24 h，以2～3 d为宜，取材后再固定2～6 h。

1.2.3取材 大体组织固定完成后可根据观察需求再自行取材，组织块的理想体积为2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，根据制片材料特性和目的不同也可适当调整。根据观察目标选取合适切面，切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回拖拉，夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。

1.2.4脱水 首先创建Leica ASP300S脱水机常用程序，首次使用先设定系统日期、蜡缸温度、试剂列表、试剂站点等参数，再根据需求创建脱水程序和清洁程序，编辑程序步骤运行顺序，每个步骤选取试剂，步骤时长，脱水缸温度及压力，排液时间和延迟步骤等。本实验使用脱水程序如下：福尔马林40 min→水1 h 30 min→75%乙醇1 h 30 min→85%乙醇1 h 30 min→95%乙醇1 h 30 min→无水乙醇55 min→无水乙醇1 h→二甲苯1 h→二甲苯1 h 15 min→石蜡Ⅰ40 min→石蜡Ⅱ 50 min→石蜡Ⅲ 1 h。

脱水机操作流程：(1)打开脱水机开关，根据显示屏提示时长提前预热融蜡，一般约10 h左右，石蜡完全融化后才能开始脱水程序；(2)样本组织块放入包埋盒，包埋盒放入样品篮，样品篮放入脱水缸后盖紧缸盖；(3)在“所有程序”中，选择之前创建的脱水程序，核对执行程序抽取试剂缸顺序及相应时长，设置组织块数和完成时间；(4)点击开始键开始脱水程序，显示屏显示开始灌注；(5)脱水完成后点击确认完成，取出样品篮中包埋盒后放回脱水缸；(6)选择清洗程序后自动运行清洗流程；(7)确认清洗程序完成后，点击“退出程序”，关闭开关。

1.2.5包埋 Leica HistoCore Arcadia H石蜡包埋机可通过控制面板设置蜡缸、托盘和工作区各区域不同温度，分配器的出蜡量可通过上方的计量旋钮进行调节，通过按压压力夹控制石蜡流出。Leica HistoCore Arcadia C石蜡包埋机是一个具有高制冷性能的冷板，可使工作温度稳定在-6 ℃。

包埋操作流程：(1)打开包埋机开关，提前预热融蜡，一般约5 h左右，石蜡完全融化后可开始包埋操作；(2)将脱水缸中取出的包埋盒及包埋模具放入包埋盒托盘中恒温；(3)用恒温镊子夹取包埋模具放置于石蜡分配器下方，按压力夹加注少量石蜡；(4)取出组织块放置于包埋模具底部中央，调整组织块切面朝下并尽量展平；(5)将包埋模具放置于冷却点定型，放置包埋盒于模具上，再转移至分配器下，加注石蜡与包埋盒高度齐平；(6)将模具转移至冷板，使包埋蜡块凝固；(7)从模具中取出蜡块，包埋完成，关闭开关。

1.2.6切片 Leica RM2235转轮式切片机操作流程：(1)切片前可将包埋蜡块置于4 ℃冰箱约2 h，使蜡块彻底凝固便于切片；(2)将样品蜡块放置于样品夹上夹紧，向下折收护刀器，松开刀架右侧锁杆，从右边侧面推入一次性旧刀片，确定刀片与压板上沿平行，旋紧锁杆夹紧刀片；(3)通过移动锁杆，调整刀架和刀架底座位置，使刀片与样品蜡块接近；(4)缓慢转动粗修手轮，同时可按住修块锁杆，对样品蜡块进行粗修直至露出合适的组织切面(粗修杆有10 μm与30 μm两个修块级)；(5)粗修完成后，重新安装新刀片。转动切片厚度调节钮，设置切片厚度为3～4 μm，松开右侧手轮锁，顺时针匀速转动手轮开始切片；(6)将连续完整的蜡带用毛笔扫下，镊子夹取蜡带放于摊片机上。

1.2.7摊片 Leica HI1210摊片机操作流程：(1)打开摊片机开关，设定恒定温度(42 ℃)，待显示屏上显示达到恒定温度；(2)用镊子将蜡带轻轻平铺在水面上，借助水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平；(3)待蜡带在恒温水面上充分展平后，用镊子轻轻分离出目标蜡片；(4)将载玻片伸入水下，从下往上捞出目标蜡片，贴在载玻片1/3交界处；(5)在载玻片磨砂处标记切片信息，倾斜放置载玻片，去除多余水分待用。

1.2.8烘片 Leica HI1220烘片机是具有良好制热恒温性能的电热板，可使电热板保持在设定的恒定温度，操作简单方便。本实验所设烘片温度为59 ℃，将贴有蜡片的载玻片置于电热板上25 min，以玻片上组织蜡边熔解为宜。

1.2.9染色 首先创建Leica AutoStainerXL自动载玻片染色机常用程序，设置通用运行参数，包括烤箱温度，站点中玻片架上下移动次数，从站点中取出玻片架过程时间，向站点中插入玻片架过程时间等。创建染色程序，设置步骤顺序编号、试剂站点、孵育时间及孵育时间精确性，一个程序最多可以编辑25个步骤，编辑完程序保存。本实验采用苏木素-伊红染色法(HE染色法)，使用染色程序如下：二甲苯8 min→二甲苯8 min→无水乙醇5 min→无水乙醇4 min→90%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→流水冲洗3 min→苏木素5 min→流水冲洗3 min→1%盐酸酒精8 s→流水冲洗3 min→稀氨水1 min→流水冲洗3 min→70%乙醇1 min 20 s→80%乙醇1 min 20 s→95%乙醇2 min→伊红4 s→95%乙醇1 min 20 s→95%乙醇1 min 20 s→无水乙醇5 min→无水乙醇5 min→二甲苯5 min。

染色机操作流程：(1)准备各试剂盒试剂，每盒试剂量至少300 mL；(2)打开染色机开关及连接的水龙头开关；(3)通过显示屏及按键选择染色程序后，机器自动进行一次自检，通过机械臂及传感器查看各试剂盒是否有试剂；(4)自检结束，LOAD键指示灯亮，将玻片装载入玻片架卡槽，放置玻片架于LOAD试剂空盒位置；(5)按下LOAD键，指示灯灭即自动开始染色程序；(6)染色完成后，EXIT灯亮，按EXIT键取出玻片架；(7)关闭机器，染色完成。

1.2.10封片 将玻片从透明剂(二甲苯)中取出，用巴氏吸管吸取中性树胶1～2滴于切片上，将盖玻片一侧接触载玻片上的中性树脂，缓慢放下盖玻片防止产生气泡及中性树脂溢出。

1.2.11镜检 将封固的切片放置于光学显微镜下观察，查看染色情况，利用计算机结合显微镜摄影系统，及时拍摄镜检图像，以数字化切片图像形式永久保存病理组织切片最佳观察状态。

2 结果

运用该系统脱水后猪肝脏组织软硬适中，石蜡切片完整，染色清晰鲜艳。将切片置于显微镜下镜检，可见肝小叶边界清晰，苏木素碱性染料将肝细胞核染成蓝紫色，核大而圆，居中；伊红酸性染料将细胞质染成淡粉色；肝细胞以中央静脉为中心向周围放射状排列形成肝索，细胞形态正常，肝索间隙为肝血窦(图2)。

图2 猪肝脏组织HE染色(×200)

3 讨论

3.1Leica病理切片系统相关注意事项 Leica病理切片系统中包含的大型仪器价格昂贵，只有平时严格按照说明书相关要求规范操作，注意保养维护，才能保证制片质量稳定，同时延长机器使用寿命。

Leica ASP300S高级智能脱水机由上部脱水模块及下部试剂模块组成，脱水模块包含触摸屏，三个蜡缸及一个脱水缸，试剂模块包含13个试剂瓶和一个冷凝瓶。脱水机试剂柜中福尔马林固定液、梯度浓度乙醇、二甲苯等试剂，在使用前要检查各试剂瓶液位是否在警示标志线内，在使用一段时间后，由于试剂挥发或残留引起浓度降低，要注意定期更换，根据样本量一般为处理约500个样本后进行更换，以免影响脱水效果。脱水机脱水缸内有上下两个液面传感器探头，分别为高位和低位报警，试剂长期使用里面融蜡或杂质过多，会造成管道堵塞，或积蜡遮盖探头造成错误报警，每次使用前可蘸取二甲苯擦洗探头表面，并注意定期更换试剂，尤其是清洗二甲苯试剂中若出现浑浊，要及时更换试剂[3-4]。此外，每次程序结束后，及时用软纸将脱水缸内的余蜡擦净，可延长清洗用二甲苯使用时间，蓝色冷凝瓶中的废液要及时清除。

Leica AutoStainerXL自动载玻片染色机主要由机械臂、试剂容器站点和控制面板三部分组成，其中试剂容器站点包括18个试剂站点，3个冲洗站点，烤箱站点、加载玻片架站点和卸载玻片架站点各1个。整个试剂容器站点和机械臂都被一个透明顶罩密闭，加载和卸载玻片架可通过抽屉完成，而无需打开顶罩，仪器背面连接有进水管和出水管。染色机开机的同时，要打开接水管连接的自来水开关，若长时间未使用再次启用，需先关闭自来水开关，拆下机器背面接水管，打开水龙头冲洗管道至出水清澈后复位，再开始后续操作，染色结束后关闭自来水开关；为避免试剂挥发或污染，在使用过程中要盖上透明防护罩，使用后要盖上各试剂槽盖，下次使用时再打开；水槽底部的进水孔容易产生霉菌，要注意及时清洁防止污染堵塞，各试剂也要注意定期更换以免影响染色效果[3]。

3.2在动物疾病诊断方面的应用 病理组织切片作为动物疾病诊断重要参考依据，可实现对组织结构病理变化的直接观察，有其不可替代的作用。如鸡马立克氏病主要通过临床症状观察和病理剖检做初步诊断，但易与淋巴白血病、网状内皮细胞增殖症等肿瘤病混淆，通过制作组织病理切片观察其典型细胞形态和组织结构变化，对其进行病理学诊断，可作为该病诊断的重要参考依据[5-6]。

在动物寄生虫病诊断方面，传统方法大多依赖于寄生虫病原体的检出，但对于原虫类寄生虫肉眼无法直接观察，及感染早期的幼虫容易漏检，探索通过快速制备病理组织切片，结合免疫组织化学(特染)技术、原位PCR等方法诊断寄生虫病有其自身优势[7]。已有研究报道，用改良的革兰氏染色法和甲基绿派诺宁染色法，实现兔脑炎原虫的快速确诊，同时可通过虫体的外部形态和内部结构观察判断宿主所处感染阶段，为后期针对性用药和宿主处置具有指导意义[8]。