高效液相色谱法测定分析原料药氟胞嘧啶中有关物质的方法验证

（精华制药集团南通有限公司，江苏南通 226407）

5-氟胞嘧啶（5-Flμcylosine） （简称5-FC），化学名为4-氨基-5-氟-2（1H）-嘧啶酮，对隐球菌属和念珠菌属等具有较高抗菌活性，对着色真菌、少数曲霉菌属有一定抗菌活性，其抗菌作用在临床上得到广泛应用，其药用机制是替代尿嘧啶进入DNA 分子中，阻断核酸合成，也是抗癌原料药卡培他滨、氟西他滨关键中间体[1]。

5-氟胞嘧啶的杂质控制方法在中国药典中已有摘录，但应对国外市场，必须符合欧洲以及美国药典的要求。为此，本实验室为更好地控制产品质量，在中国药典的基础上，结合欧洲及美国药典的要求，对测试方法进行了专题研究和一定程度的优化。

1 探讨与分析

1.1 检测方法的选择

美国药典采用薄层色谱法（TLC）检测5-氟胞嘧啶的有关物质，中国药典和欧洲药典都采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）检测5-氟胞嘧啶的有关物质。高效液相色谱法用作定量分析时，较薄层色谱法更为准确，且精确度和灵敏度高。因此，选择HPLC 测定5-氟胞嘧啶的有关物质。

1.2 流动相的选择

为选取最优的流动相体系，分别考察了中国药典方法流动相A（甲醇-水）、欧洲药典方法流动相B（甲醇-磷酸二氢钾水溶液）、流动相C（甲醇-磷酸二氢钠水溶液）3 种流动相体系，在同一浓度下进行峰面积比较。结果表明，当选取流动相C 时，其灵敏度和峰形达到最佳，相邻峰之间的分离度较好，因此最终选择流动相C 作为最优流动相体系。

1.3 检测波长的确定

为选取最合适的检测波长，用加有杂质的氟胞嘧啶溶液在200 ～ 380 nm 进行波长扫描。测试结果表明，在260 nm 处，氟胞嘧啶和其杂质均有较大吸收，故选择260 nm 作为检测波长。

2 改进后的方法学验证

2.1 验证参数

专属性、重复性、中间精密度、准确度、检出限、定量限、线性范围、耐用性[2-5]。

2.2 仪器与试剂

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪及Labsolution CS工作站、色谱柱C18（4.6×250 mm×5μm）、氟胞嘧啶标准品（R03100）、氟尿嘧啶标准品（R009T0）、氟胞嘧啶原料药（自制）等。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2.3 色谱条件

流动相：称取2.72 g 磷酸二氢钠溶于1 800 mL纯化水中，用磷酸调节pH 至3.0，然后加入一定量的甲醇，使溶液的甲醇浓度为5%，用0.45μm 过滤膜过滤，脱气即得。流速0.8 mL/min，检测波长260 nm，进样量20 μL，柱温25 ℃。

进样次序：第一针进空白，接着进系统适应性试液、氟尿嘧啶对照液、标准溶液稀释液各一针，然后进五针标准液（第一份），再进一针标准液（第二份），再进两针平行样品，最后再进一针标准液（第一份）。连续进样品的针数不得超过十针，超过十针需每十针间隔进一针标准液（第一份）。标准液（第二份）用于计算回收率。

系统适应性要求：重复进6 针标准溶液，在所得的色谱图中，要求6 针标准溶液氟胞嘧啶峰面积的RSD ≤2.0%，系统适应性溶液中氟胞嘧啶与氟尿嘧啶的分离度R≥2。按照外标法以峰面积进行计算，即得含量。

2.4 样品与对照制备

2.4.1 标准对照溶液配置

标准溶液：准确称取10 mg 氟胞嘧啶标准品于100 mL 容量瓶中，加入80 mL 水，用超声波完全溶解后定容。

标准溶液稀释液：精密吸取1 mL 标准溶液用超纯水稀释至100 mL，再吸取1 mL 前溶液用超纯水稀释至10 mL。

氟尿嘧啶对照液：精密称取取氟尿嘧啶标准品10 mg，加超纯水使溶解成200 mL，准确吸取该溶液1.0 mL 稀释至100 mL，再准确吸取稀释液 1.0 mL 稀释至 10 mL，即得。

加杂测试液：准确称取10 mg 样品于100 mL 容量瓶中，加入100 μL 氟尿嘧啶对照液中配制过程中的0.05 mg/mL 的高浓度溶液，加适量的水超声溶解后定容。

2.4.2 样品测试溶液

准确称取10 mg 样品于100 mL 容量瓶中，加入80 mL 水，用超声波完全溶解后定容，即得。

3 实验结果

3.1 专属性

将氟尿嘧啶对照液、标准溶液稀释液、系统适应性溶液、标准溶液、样品测试溶液、加杂测试液，分别进样。检测结果见表1。

表1 专属性的检测结果Tab.1 Test results of specificity

对比所测试的每张色谱图，样品、杂质、对照的出峰时间没有重叠或交叉，且峰型近似于对称形正态分布曲线，不拖尾，不前伸。样品溶液中氟胞嘧啶与相邻杂质峰分离度为10.01，系统适应性溶液中氟胞嘧啶与氟尿嘧啶的分离度为10.13。测试结果表明空白溶剂不干扰本品的有关物质的检查，样品对杂质出峰无干扰，各峰之间能有效分离，该方法专属性强。

3.2 重复性

分别配制6 份标准溶液，每份各进样1 针，六次测定的氟胞嘧啶峰面积RSD 为0.02%。

分别配制6 份加杂测试溶液，每份溶液进样1针，用氟尿嘧啶对照液中氟尿嘧啶的峰面积计算杂质的回收率，六次测定主峰氟胞嘧啶平均回收率为101.03%，回收率的相对标准偏差RSD 为0.01%；杂质氟尿嘧啶平均回收率为100.66%；回收率的相对标准偏差RSD 为0.31%。从该项测试的RSD 结果可知，该方法具有良好的重复性。

3.3 中间精密度

由不同的分析员在不同的时间用另外一台仪器，按照重复性项的方法进行测试。两组12 次测定结果，杂质氟尿嘧啶平均回收率为102.12%，回收率相对标准偏差RSD 为1.66%；氟胞嘧啶平均回收率为101.50%，回收率相对标准偏差RSD 为0.48%；证实该方法中间精密度良好。

3.4 检出限

在选定的色谱条件下，以信噪比（S/N）约为3时相应的试样浓度来确定，杂质氟尿嘧啶的检出限为0.003 5 μg/mL，氟胞嘧啶的检出限为0.007 0 μg/mL。

3.5 定量限

把已知浓度样品溶液稀释到低浓度的试样，测出的信号与空白处的信号（基线噪音）进行比较，算出能被可靠检测出的最低浓度或百分比。以信噪比（S/N）约为10 时相应的试样浓度来确定，杂质氟尿嘧啶定量限为0.01 μg/mL，氟胞嘧啶定量限为0.02 μg/ mL。

3.6 线性及范围

在LOQ 浓度至不低于120%指标浓度的范围内取6 个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号（峰面积）对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，要求线性相关系数r≥0.996。测得杂质氟尿嘧啶线性回归方程y= 84 059x+ 13.206，相关系数r= 0.999 9（见图1）；测得氟胞嘧啶线性回归方程y= 48 522x+ 17.194，相关系数r= 0.999 8（见图2）。测试结果表明，杂质氟尿嘧啶质量浓度在0.01 ～ 0.06 μg/mL 范围内，氟胞嘧啶质量浓度在0.02 ～ 0.12 μg/mL 范围内，具有良好的线性关系。

3.7 准确度

准确度测定：加入浓度为样品配置浓度，检出浓度为样品通过液相色谱检测出峰面积然后换算成浓度，回收率=检出浓度/加样浓度×100%。

在不含氟胞嘧啶的空白溶剂（超纯水）中，加入氟胞嘧啶标准品，配置成标准溶液浓度的80%、100%、120% 三种溶液，分别进样。测得杂质氟尿嘧啶回收率在99.65%～100.08%，定量限处回收率在99.30%～100.30%，氟胞嘧啶回收率在97.75%～97.91%，定量限处回收率在97.84%～97.87%，符合验证要求。

图1 杂质氟尿嘧啶线性关系图Fig.1 Linear relationship of impurity fluorouracil

图2 氟胞嘧啶线性关系图Fig.2 Linear relationship of fluorocytosine

测试结果表明，此方法测得的结果与真实值之间较为接近，且在同一水平浓度上有较高的精确度，该测试方法准确度高。检测结果见表2、表3。

3.8 耐用性的测定

3.8.1 溶液的稳定性

通过配制标准溶液、样品测试溶液、加杂测试溶液，在自然常温环境下，将容量瓶中的溶液放置0 h、8 h、12 h、24 h 和48 h 后进行测试，计算峰面积RSD。测试结果（见表4），供试品溶液在自然常温条件下放置48 h 内稳定性良好。

3.8.2 流速的影响

配制加杂测试溶液，在不改变其他色谱条件的前提下，分别设定流动相流速为0.7 mL/min、0.8 mL/ min、0.9 mL/min，评估测定条件参数微小变动时，主峰氟胞嘧啶和杂质氟尿嘧啶峰面积的回收率。测试结果（见表5）表明，三种流速下对样品的测试结果影响不大。

表2 杂质氟尿嘧啶准确度的测试结果Tab.2 Test results of accuracy of impurity fluorouracil

表3 氟胞嘧啶准确度的测试结果Tab.3 Test results of accuracy of fluorocytosine

表4 溶液的稳定性测试结果Tab.4 Stability test results of solution

3.8.3 柱温的影响

配制加杂测试溶液，在不改变其他色谱条件的前提下，分别设定色谱柱温度为23 ℃；25 ℃；27 ℃分析，评估测定条件参数微小变动时，主峰氟胞嘧啶和杂质氟尿嘧啶峰面积的回收率。测试结果（见表6）表明，柱温在23 ～ 27 ℃范围内，对样品的测试结果影响不大。

表5 流速对测试结果的影响Tab.5 Effect of flow rate on test results

表6 柱温对测试结果的影响Tab.6 Effect of column temperature on test results

3.8.4 色谱柱的影响

配制加杂测试溶液，在不改变其他色谱条件的前提下，分别采用同一生产商两个不同批号的色谱柱分析，评估测定条件参数微小变动时，主峰氟胞嘧啶和杂质氟尿嘧啶峰面积的回收率。测试结果（见表7）表明，同一生产商不同批号的色谱柱对样品的测试结果影响不大。

表7 色谱柱对测试结果的影响Tab.7 Influence of chromatographic column on test results

3.8.5 流动相pH 值的影响

配制加杂测试溶液，在不改变其他色谱条件的前提下，调节流动相的pH 值分别为2.8、3.0、3.2，评估测定条件参数微小变动时，主峰氟胞嘧啶和杂质氟尿嘧啶峰面积的回收率。测试结果（见表8）表明，流动相pH 值在2.8 ～ 3.2 范围内，对样品的测试结果影响不大。

表8 流动相pH 值对测试结果的影响Tab.8 Influence of pH value of mobile phase on test results

3.9 样品测试

分别称取FLC2020001、FLC2020002、FLC2020003 三个批号的样品进行测试，结果显示该三批样品中杂质氟尿嘧啶和未知杂质均未检出。

4 结论

本文对现有5-氟胞嘧啶中有关物质的质量控制方法进行了研究与探讨，建立了更为严格、准确的检测方法，即在本实验室确立的条件下，采用高效液相色谱法测定氟胞嘧啶中的有关物质，并对线性试验、精密度试验、准确度试验、耐用性试验进行方法验证。

测试结果表明空白溶剂不干扰本品的有关物质的检查，样品对杂质出峰无干扰，样品溶液中氟胞嘧啶与相邻杂质峰分离度为10.01，专属性强。重复性项下的测试结果RSD 为0.02%。中间精密度项下，杂质氟尿嘧啶平均回收率为102.12%，RSD 为1.66%；氟胞嘧啶平均回收率为101.50%，RSD 为0.48%。杂质氟尿嘧啶的检出限为0.003 5 μg/mL，氟胞嘧啶的检出限为0.007 0 μg/mL。杂质氟尿嘧啶定量限为0.01 μg/mL，氟胞嘧啶定量限为0.02 μg/mL。杂质氟尿嘧啶质量浓度在0.01 ～ 0.06 μg/mL，氟胞嘧啶质量浓度在0.02 ～ 0.12 μg/mL，具有良好的线性关系。耐用性测试结果表明，样品溶液在自然常温条件下放置48 h 内稳定性良好；流动相流速为（0.8 ± 0.1） mL/ min、色谱柱温度为（25 ± 2） ℃、流动相pH 值为2.8 ～ 3.2，对样品的测试结果影响不大。表明该控制方法重复性好，专属性强，检测结果准确、可控，可以有效控制该产品的质量。