结直肠癌患者中性粒细胞淋巴细胞比值和T淋巴细胞CD69变化的意义

韩克松，张 帆，李翠玲，张 静，邸泰霖，肖德亮

结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤，发病率逐年增加，发病年龄逐渐年轻化，临床上主要采用手术切除治疗，但术后五年生存率仍然较低[1]。结直肠癌患者早期临床症状不明显，早期筛查和诊断率很低，大多数患者被发现时已经处于晚期。寻找简单可靠的结直肠癌预后指标对早期筛查，治疗和预后评估具有重要的意义。与肿瘤相关的炎性细胞可以直接或间接与肿瘤相互作用，促进肿瘤血管生成，细胞外基质重塑和肿瘤转移[2]。中性粒细胞淋巴细胞比值（NLR）可以作为全身炎症反应的指标，评估人体抗肿瘤和促肿瘤免疫之间的动态平衡[3]。研究证实NLR与卵巢癌、肺癌、乳腺癌和肝细胞癌等多种恶性肿瘤的预后有关[4]。T淋巴细胞必须在参与免疫反应前首先被激活，CD69是T淋巴细胞活化的分子标记，可诱导Th1类细胞因子。T淋巴细胞在静止状态下不表达，但是一旦T淋巴细胞被激活，黏附在表面的CD69就会以非常快的速度表达。一般认为，在肿瘤发生后为肿瘤的生长和转移创造环境，并且在患者接受相应治疗前，体内的免疫功能通常很低，因此可以通过分泌一些免疫因子来抑制免疫功能[5]。本研究通过检测126例结直肠癌患者外周血中T淋巴细胞CD69、NLR水平，以期探讨结直肠癌患者术前外周血中T淋巴细胞CD69、NLR变化的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年5月—2018年12月我院收治的126例结直肠癌患者（病例组）、120例结肠息肉患者（对照组）。纳入标准：1）结直肠癌、结肠息肉的诊断标准参考人民卫生出版社《外科学》第七版中的标准[6]；2）术前经结直肠镜取活组织病理学检查证实诊断；3）所有患者均在我院接受腹腔镜根治手术治疗，术后取标本接受病理学检查；4）本研究符合医学伦理委员会的相关要求，获得研究对象的知情同意。排除标准：1）术前具有放化疗病史；2）术前接受免疫学治疗；3）病理学资料缺失；4）伴有其他部位的恶性肿瘤。

病例组中男68例、女58例，年龄39～75岁，平均（55.2±7.8）岁；体质指数（BMI）（22.8±2.2）kg/m2；其中结肠癌47例、直肠癌79例；TNM分期：Ⅰ期27例、Ⅱ期45例、Ⅲ期44例、Ⅳ期10例；发生淋巴结转移49例。对照组中男61例，女59例；年龄36～75岁，平均（53.8±8.4）岁；BMI（22.6±2.4）kg/m2；两组年龄、性别、BMI差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 指标检测方法

1.2.1 NLR 患者禁食12 h，取3 mL外周静脉血。用贝克曼库尔特LH750自动血液分析仪测量中性粒细胞计数，淋巴细胞计数，计算NLR。

1.2.2 CD69 收集患者100 μL全血，加入20 μL荧光标记的CD69抗体（APC、FITC、PE标记抗人CD69单抗），APC、FITC、PE波长分别不同，分别选择深红色、亮绿色和橘红色3个流式通道，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。在室温下避光孵育20 min；加入1 mL溶血素，室温避光10 min；加入1 mL PBS缓冲液，混合，以1 000 r/min离心5 min；弃去上清液，再次加入1 mL PBS缓冲液，重复混合并离心；弃去上清液，加入0.5 mL PBS缓冲液进行流式细胞术，使用Cell Quest软件获取并分析数据。

1.3 资料收集 收集病例组的年龄、性别、BMI、肿瘤位置、直径大小、病理学类型、肿瘤分化程度、是否伴有肠梗阻、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤淋巴血管侵犯。

2 结果

2.1 病例组和对照组的外周血中T淋巴细胞CD69、NLR比较 病例组外周血中T淋巴细胞CD69表达水平低于对照组，NLR值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 病例组和对照组的外周血中T淋巴细胞CD69、NLR比较

2.2 外周血中T淋巴细胞CD69表达与结直肠癌患者病理学特征的关系 不同肿瘤分化程度、不同TNM分期、是否发生淋巴结转移、是否发生肿瘤淋巴血管侵犯的结直肠癌患者T淋巴细胞CD69表达差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 外周血中T淋巴细胞CD69表达与结直肠癌患者病理学特征的关系

2.3 外周血中NLR值与结直肠癌患者病理学特征的关系 不同肿瘤分化程度、不同TNM分期、是否发生肿瘤淋巴血管侵犯的结直肠癌患者的血NLR值差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 外周血中NLR值与结直肠癌病理学特征的关系

3 讨论

对于结直肠癌患者的预后评价，主要包括肿瘤分化程度，淋巴结和远处转移，临床分期等[7]。但是除了传统的临床病理指标外，影响患者的预后因素较多。相关研究表明慢性炎症逐渐发展恶化会导致许多恶性肿瘤的发生[8-9]。肿瘤的炎症反应和宿主的保护性免疫能力是相互关联的动态过程，当炎症反应发生改变打破动态平衡时引起肿瘤的生长发育。因此，寻找准确易得的指标反映肿瘤的侵袭和转移具有重要意义。慢性炎症反应会产生一些毒素应激，同时炎症细胞通过增加血管生成和组织浸润来诱导细胞增殖，促进癌症的发展和扩散[10]。研究表明中性粒细胞，淋巴细胞，血小板和单核细胞等炎症细胞和人体固有的免疫系统信号分子参与了肿瘤的发展[11-12]。与肿瘤病理分期相比，各种炎症细胞的数量变化可能对癌症患者术前状态有更好的了解[13]。NLR是系统性炎症反应的代表性指标，可以用于结直肠癌患者的潜在预后因素研究。

NLR是反映机体免疫状态的重要指标，其水平高低与肿瘤特点有关。肿瘤发生时，患者机体中性粒细胞的含量增加，活化并从静脉系统迁移到肿瘤细胞周围，促进肿瘤发展[14-15]。另一方面，全身性炎症反应使宿主的CD4+ T淋巴细胞含量减少，CD8 + T淋巴细胞的增加受抑制，大大降低了人体的细胞免疫力[16]。肿瘤的发生和转移与免疫逃逸有关，T细胞的活化在免疫监视中具有重要作用[17]。CD69是T淋巴细胞活化后表达的膜表面分子，当受到激活后，它可以进一步刺激T细胞的增殖和活化过程，诱导Th1类细胞因子的分泌，并间接杀死肿瘤，我们可以检测CD69表达的激活情况，以验证T淋巴细胞的激活情况，并探讨切除肿瘤后是否可以逆转肿瘤患者的免疫抑制作用。T淋巴细胞表面上有许多标志性分子，而CD69是最早表达的分子。因此，以前的研究通常在肿瘤患者手术后的第一天检测CD69的表达[18]。

本次研究结果显示，病例组的外周血中T淋巴细胞CD69表达明显低于对照组。主要由于结直肠癌患者体内T细胞活化不足，难以进行肿瘤免疫监视，导致手术前肿瘤免疫抑制，更有利于肿瘤的生长，浸润和转移。病例组 NLR值明显高于对照组。由癌症引起的炎症反应可导致NLR比例增加，NLR升高表示中性粒细胞数量增加，淋巴细胞数量减少。淋巴细胞是抗肿瘤免疫力的主要成分，数量减少表明人体免疫功能异常，淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫力下降，从而促进了肿瘤的生长和转移。更重要的是，NLR可能在促进肿瘤炎症和抗肿瘤炎症之间起到平衡作用。本研究显示，NLR值变化与患者不同肿瘤分化程度、不同TNM分期、是否发生肿瘤淋巴血管侵犯密切相关。随着肿瘤的发展，人体的全身炎症反应和抗肿瘤免疫抑制不平衡。肿瘤TNM分期增加，肿瘤分化严重，发生肿瘤淋巴血管侵犯，使得中性粒细胞和淋巴细胞比例失调，NLR不仅反映了肿瘤的进展程度，还表明人体对肿瘤的免疫力降低，这对临床治疗计划和预测患者预后具有重要意义。

在当前的临床工作中，炎症反应指数NLR的增加已被证明与恶性肿瘤的预后有关，并且在结直肠癌，肺癌，肝癌和胃癌的研究中已被广泛报道[19-20]。但目前较多结直肠癌研究中仅对NLR单一指标进行检测，说明性不强。本研究对结直肠癌患者术前进行T淋巴细胞CD69和NLR进行检测，充分说明结肠癌患者机体免疫炎症反应变化，探讨其与肿瘤的进展关系。在以后的研究中，是否可以使用抗炎治疗来提高结直肠癌对化疗药物的敏感性并延长患者的生存期，值得进一步探讨。

综上所述，结直肠癌患者的外周血中T淋巴细胞CD69表达降低，NLR值增高，并且与肿瘤的进展有一定的关系。