肝细胞癌中组蛋白甲基化酶SET结构域分支型1的表达及其临床意义

杨 静，马景涛，艾力·伊敏，闫 骏

肝细胞癌为我国消化系统恶性肿瘤中的常见类型，属于原发性肝病范围，在原发性肝癌中占比90%左右[1]，其死亡率相对较高，在现阶段全球范围内癌症相关死亡原因中占据第三位[2]。近年来，关于肝细胞癌发病机制的研究得到本领域专家的广泛关注，很多研究都在探索其分子发病机制[3]。肝细胞癌中组蛋白甲基化酶SET结构域分支型1（SETDB1）属于组蛋白赖氨酸N端甲基转移酶，其编码基因的位置为人类染色体1q21上。研究发现，在乳腺癌[4]、卵巢癌[5]患者中，SETDB1的表达水平较高时，可能会对肿瘤细胞迁移、增殖及侵袭过程发挥促进作用，因此，SETDB1可作为预测癌症患者预后的重要指标。目前，在肝细胞癌中研究SETDB1的表达情况较少见，本研究选取确诊的肝细胞癌患者，选取其癌组织和癌旁组织，展开对比分析，了解肝细胞癌中SETDB1的表达情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年3月—2020年6月天津市第一中心医院收治的90例肝细胞癌患者，其中男78例，女12例，年龄41～82岁，平均（61.32±4.52）岁；瘤体数量：单个瘤体80例，2个及以上瘤体10例。肿瘤直径为1～17 cm，若瘤体数量为2个及以上，计算其直径总和作为直径数值，其中直径为6 cm及以上者18例，小于6 cm者72例。

1.2 纳入标准与排除标准

1.2.1 纳入标准 1）均经手术切除获得标本，经检查确诊为肝细胞癌；2）标本在离体后30 min内取材，在中性甲醛溶液内保存并固定；3）未合并其他恶性肿瘤，无严重的肝肾功能障碍；4）患者同意自身标本用于临床实验。

1.2.2 排除标准 1）无法接受手术治疗，而是通过化疗或放疗治疗的患者；2）不愿自身资料被用于临床研究；3）其他部位恶性肿瘤转移所致的肝癌患者。

1.3 方法 1）取样：对患者HE切片进行调阅，从每位患者中选取癌细胞含量为70%以上的蜡块，同时选取配对的癌旁正常肝组织蜡块1个，注意将坏死区域、出血区域避开。2）所用试剂和仪器：所用检查试剂盒为FFPE RNA提取试剂盒、qRT-PCR仪，其中SETDB1引物由Primer5.0软件制作，上游引物：5‘-CTATATGACTTCCGGCCGGATGA-3’，下游引物：5‘-GCATTGTCCGAAGGCAGAGA-3’。3）免疫组化染色：将标本组织切片（石蜡包埋）常规脱蜡，实施水化预处理，以抗体稀释液按照1:100的比例对兔抗人SETDB1多克隆抗体进行稀释，在组织切片上滴加抗体，注意需将组织标本完全浸没。放在4 ℃恒温箱中，孵育过夜，将未结合一抗洗净，以辣根过氧化物酶标记后的山羊抗兔二抗和相应一抗结合，以DAB法促使阳性蛋白显示。对各组织切片，于400倍视野下，随机抽查10个视野，若癌细胞胞核有10%以上为棕褐色或棕黄色，则可判定为阳性。4）qRT-PCR检测：将肝细胞癌组织、癌旁组织各个样本切成厚度为5 μm，每份标本共4张切片，放在EP管内，根据试剂盒操作说明书提取其中的总RNA，对其纯度、浓度进行检测，若总RNA纯度（A260/A280）数值为1.8～2.1，则判定为合格。所有样本均采集RNA样品1 μg，实施qRT-PCR反应，其体系20 μL，反应条件为55 ℃下行逆转录，共10 min；之后在95 ℃下行1 min预变性，在95 ℃下实施10 s循环，在60 ℃下行1 min循环，共循环40次。各个样本重复试验3孔。采用2-△△Ct法计算SETDB1相对表达量。

1.4 观察指标 1）评估肝细胞癌组织、癌旁组织中SETDB1的表达情况。2）对不同年龄、性别、肿瘤直径、癌细胞不同分化程度、有无肝硬化患者、不同分型、分期肝细胞癌患者的SETDB1表达情况进行统计分析。

2 结果

2.1 SETDB1的表达情况 免疫组化染色中，SETDB1位置为细胞核内，其阳性表达情况见表1。经对比，癌组织中SETDB1阳性率明显高于癌旁组织（P＜0.05）。经qRT-PCR检查，发现肝细胞癌组织中的SETDB1相对表达量为（1.674±0.287），癌旁组织中为（1.215±0.147），经对比差异有统计学意义（t=13.504，P＜0.001）。

表1 癌组织和癌旁组织中SETDB1的表达情况

2.2 不同年龄、性别、肿瘤直径患者SETDB1的检测情况 不同年龄、不同性别患者的肝细胞癌样本中，癌组织SETDB1水平组间差异无统计学意义（P＞0.05）；肿瘤直径为6 cm及以上者的癌组织SETDB1水平明显高于肿瘤直径不足6 cm者（P＜0.05）。见表2。

表2 不同年龄、性别、肿瘤直径肝细胞癌患者SETDB1的测定结果

2.3 不同分化程度、有无肝硬化肝细胞癌患者SETDB1的水平 不同癌细胞分化程度、肝硬化患者，癌组织SETDB1水平组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同分化程度、有无肝硬化肝细胞癌患者SETDB1的测定结果

2.4 不同分型、分期肝细胞癌患者SETDB1的测定结果 MVI分型中，M1+M2分型的癌细胞SETDB1水平明显高于M0分型（P＜0.05）；pTNM分期中，Ⅲ+Ⅳ期患者癌细胞SETDB1水平明显高于I +II期（P＜0.05）。见表4。

表4 不同分型、分期肝细胞癌患者SETDB1的测定结果

3 讨论

近年来，随着生活环境不断变化、生活方式逐渐改变，全球范围内的癌症患者数量逐渐增多。肝细胞癌属于常见疾病类型，若不能及时治疗，患者死亡风险较高，肝细胞癌的治疗引起了人们的关注，然而部分患者经治疗后，效果仍不佳，故而临床医师近年来日益重视探索肝细胞癌的分子发病机制，希望为此类患者的治疗提供新的靶点[6]。

肝癌表观遗传变异，对于肿瘤的发生和进展，乃至其转移及复发，均可发挥巨大作用。SETDB1属于组蛋白甲基化转移酶，能够和异染色质蛋白1、抑制子KAPI于异染色质内结合，对H3K9me3的形成发挥促进作用[7-8]。目前，有很多研究在多种恶性肿瘤中均发现SETDB1异常表达问题，但是领域内专家对这一物质的生物学功能还未获得明确结论[9]。对于非小细胞肺癌患者，SETDB1可将WNT-β-catenin信号通路正向激活，对肝细胞癌细胞增殖过程发挥促进作用，而在脑胶质母细胞瘤中，也能够发现类似的生物学行为。有研究提出，SETDB1在肝癌中水平较高，且其升高与肝癌进展、侵袭和预后情况密切相关[10]。体外实验发现，沉默SETDB1可对肝细胞癌的迁移、侵袭及增殖能力造成抑制作用[11]。本研究经免疫组化染色可知，肝细胞癌组织中SETDB1阳性表达率明显高于癌旁组织，然后用qRT-PCR技术进行检测，结果发现，肝细胞癌组织中SETDB1相对表达量明显高于癌旁组织，可见SETDB1在肝细胞癌组织内的表达水平较高，而这一指标的检测，能够对肝细胞癌的诊断提供一定依据。

本研究将肝细胞癌患者根据不同方法进行分组，进一步探索不同分期、肿瘤直径等患者的SETDB1表达情况。经对比发现，在不同性别、不同年龄的肝细胞癌患者中，虽然SETDB1表达水平有一定差异，但是差异并无统计学意义，可见性别及年龄不是影响SETDB1表达的因素。在肿瘤直径为6 cm及以上患者中，笔者发现其癌细胞SETDB1水平明显高于肿瘤直径不足6 cm患者，从这一结果可以看出，SETDB1表达水平较高的肝细胞癌组织，SETDB1的表达可能会越发活跃，因此这一指标的水平较高；随着肿瘤体积增大，不仅预示着患者治疗难度增加，同时也提示患者预后可能更差，疾病进展更加严重，由此可见，SETDB1表达情况在肿瘤进展评估中也能发挥重要作用[12-13]。

在不同癌细胞分化程度、是否伴随肝硬化的患者中，癌细胞SETDB1水平组间差异不显著，由此可见，肝硬化的有无并不会影响SETDB1的表达，而癌细胞分化程度与SETDB1表达水平之间也不存在必然的联系。研究还对MVI分型情况展开对比，结果发现，M1+M2分期的癌细胞SETDB1水平明显高于M0分期，而在不同pTNM分期的患者中，Ⅲ+Ⅳ期患者癌细胞SETDB1水平明显高于I +II期，之所以出现这一结果，是因为伴随MVI患者的肿瘤体积通常更大，而患者的生存期一般较短。而TNM分期直接反映肿瘤进展程度，Ⅲ+Ⅳ期的肿瘤进展更快，患者预后一般相对较差。从这一结论可以看出，SETDB1表达情况与微血管侵犯、肿瘤分期密切相关，推断SETDB1水平升高与肝细胞癌患者预后差之间有一定关联，因此可将SETDB1水平用作对肝细胞癌患者肿瘤进展、预后评估的一个重要指标[14-15]。陈静等[16]在研究中，发现对SETDB1进行抑制，可抑制裸鼠皮下移植瘤生长，且可导致细胞中H3K9me3水平下降，p53水平升高。我们体会到，对于SETDB1表达情况与肝细胞癌患者其他病理特征、预后之间的关系，还需继续扩大研究样本量，并考虑其蛋白表达情况，做更深入的分析。

对于肝细胞癌患者，下调SETDB1表达水平，能够对肝癌生长发挥抑制作用，这可作为后续治疗肝细胞癌的重要靶点，领域内专家可通过大量试验，探索抑制SETDB1表达水平的药物及治疗方案，来改善肝细胞癌患者的预后情况。

综上所述，肝细胞癌中组蛋白甲基化酶SETDB1的表达明显升高，且肿瘤直径较大、M1+M2型、pTNM分期较高的患者中，肝细胞癌内SETDB1的表达水平明显升高，这有望为肝细胞癌治疗方案的研制提供新的治疗靶点。