不同成熟度雪茄烟晾制过程碳水化合物及相关酶活性变化规律研究

刘博远, 赵松超, 李一凡, 贺凡, 阳苇丽, 赵铭钦*

(1.河南农业大学烟草学院, 郑州 450002; 2.海南省烟草公司儋州公司, 海南 儋州 571700; 3.天昌国际烟草有限公司, 河南 许昌 461099; 4.四川省烟草公司达州市公司, 四川 达州 635000)

雪茄作为一种用烟叶手工卷制而成的特殊烟草制品，烟叶质量直接影响到雪茄烟的品质[1]。与烤烟相似，雪茄烟的烟叶成熟度包括田间成熟度和调制成熟度[2-4]。成熟度对雪茄烟叶感官评价存在显著影响，适熟采收可使调制后的烟叶内在化学成分比例协调，烟叶在调制过程中失水速率会随着烟叶成熟度的提高而加快[5-7]。因此，烟叶适熟采收对雪茄烟的品质至关重要[8-9]。碳水化合物是绿色植物进行光合作用的主要产物，植物体内的碳水化合物主要包括淀粉、糖类、果胶、纤维素等，其中淀粉是最主要的能量存储形式，糖类物质是烟叶生长过程中含量最多的碳水化合物之一。已有研究表明，烟叶中淀粉含量与成熟度存在正相关关系，与油分、叶片长度呈显著正相关关系，与烟碱、氯之间存在负相关性，与总糖存在正相关性[10]。王传义等[11]研究表明，适熟烟叶淀粉降解较多，化学成分协调。Weeks[12]研究表明，调制后烟叶残留淀粉会对烟叶色、香、味产生不利影响，对烟叶质量产生负面作用。因此，淀粉的降解程度对雪茄烟品质有很大影响。淀粉的分解是在各种淀粉分解酶的作用下完成的，淀粉在各种酶的作用下降解生成糖类物质。向章敏[13]通过试验证明烟叶糖类物质含量与卷烟香气质、杂气量、刺激性、烟气细柔度、余味和评吸总分呈极显著正相关。包自超等[14]通过相关性分析表明,烟叶还原糖、总糖含量与含梗率、叶片厚度呈极显著负相关。因此，糖类物质含量对雪茄烟叶的品质有着重要影响。目前，不同成熟度烟叶碳水化合物含量变化以及对烟叶品质的影响多集中于烤烟上，关于不同成熟度条件下雪茄烟晾制过程中碳水化合物含量及酶活性变化的研究较少。在海南省五指山，设置3种不同成熟档次进行烟叶采收，研究雪茄烟叶在晾制过程中的碳水化合物含量以及相关酶活性的变化，旨在为五指山雪茄烟叶采收提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地点

试验于2018—2019年在海南省五指山市番阳镇进行。番阳镇地理坐标为N18°52′32″，E109°23′32″。试验地为红色沙壤土质。土层养分状况为碱解氮63.16 mg·kg-1，速效磷26.27 mg·kg-1，速效钾124.61 mg·kg-1，pH为5.9。供试材料为雪茄烟品种‘H382’，均采集中部叶片(11～12片)。大田管理按当地雪茄烟生产常规管理措施执行。

1.2 试验处理

根据烟叶的成熟度表观特征，分为尚熟、适熟、过熟3个成熟度(表1)，分别设置3个处理。每个处理选取长势基本一致，外观质量相对统一的烟叶，每个处理采摘240片，共采摘720片烟叶，将采摘的不同成熟度烟叶编杆挂入晾房(晾房规格长×宽×高为30 m×10 m×6 m，晾房材料为苫布)，挂杆可用长度为300 cm，每杆挂120片烟叶，相邻挂杆间距为20 cm，晾制工艺采用海南省五指山市当地雪茄烟自然晾制法晾制：晾制凋萎期、变黄期将烟叶挂于低温高湿的晾房下部进行晾制，在烟叶晾制变黄末期(晾制11 d)将烟叶挂于高温低湿的晾房上部进行晾制，使烟叶在该条件下进行转褐定色、干筋。

表1 不同成熟度烟叶的主要外观特征Table 1 Main appearance characteristics of tobacco leaves with different maturities

1.3 测定项目与方法

将testo184T1温湿度自动记录仪(德国testo公司)悬挂在晾房前中后的上下部位，共6个。烟叶编杆放入晾房后，在每天的8:00—16:00，每两个小时记录一次温湿度。烟叶进入晾房晾制，第1～10 d记录晾房下部的温湿度，第11～25 d记录晾房上部的温湿度。

从晾制开始每隔5 d随机选取晾制中各处理烟叶，除去整片烟叶靠近叶尖1/3和靠近叶基部1/3的部分，留取中间部分，置于100 ℃的烘箱，2 h后取出，计算含水率与失水率。同时取中间部分，测定淀粉含量[15]、淀粉酶活性[16]、淀粉磷酸化酶活性[17]及常规化学成分含量[18]。每个处理均3次重复。

1.4 数据处理

数据处理使用Microsoft excel 2010进行，采用SPSS 20.0和DPS 7.05进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 晾制过程中的温湿度变化

晾制过程中温湿度检测结果见图1，晾房内温度随着时间的增加呈现升高的趋势，在晾制结束时达到40.58 ℃，比开始时升高了14.89 ℃。晾房内湿度随着时间的增加呈现先上升后下降的趋势，在第6 d达到最高值。在晾制10 d后，晾房内温度稳定升高，晾房内湿度稳定下降。

图1 晾制过程中晾房内的温湿度变化Fig.1 Changes of temperature and humidity during drying in the drying room

2.2 晾制过程不同成熟度雪茄烟的失水率变化

不同成熟度雪茄烟在晾制过程中的失水率结果见表2。尚熟烟叶和适熟烟叶的失水率在0～10 d缓慢增长，10～15 d快速增长，15 d后又缓慢下降。过熟烟叶含水率在0～5 d急剧下降，失水率达到23.46%，5～15 d稳定增长，15 d后又缓慢下降。在晾制结束时，3种成熟度烟叶的含水率表现为尚熟>适熟>过熟。整个晾制过程以尚熟烟叶含水率最高且失水率相对较慢。在整个处理阶段，各成熟度烟叶含水率均呈现下降趋势，失水率呈现先升高后下降的趋势，均在晾制的第15 d达到最大值。这可能是因为在晾制11 d后，烟叶移至高温低湿的晾房上部晾制造成。总体上，以适熟烟叶在晾制过程中含水率和失水率较适中。

表2 不同成熟度雪茄烟晾制过程中的含水率和失水率Table 2 Moisture content and moisture loss rate during drying process in cigar with different maturities (%)

2.3 晾制过程不同成熟度雪茄烟的碳水化合物含量变化

不同成熟度雪茄烟在晾制过程中的淀粉含量结果(图2)显示，晾制0 d时，以适熟烟叶淀粉含量最高，过熟烟叶最低，二者存在显著性差异(P<0.05)。晾制5 d时，以过熟烟叶淀粉含量最高，适熟烟叶最低，二者间存在显著性差异(P<0.05)。晾制10 d后，均以过熟烟叶淀粉含量最高，适熟烟叶最低；过熟烟叶与适熟、尚熟烟叶的淀粉含量均存在显著差异(P<0.05)；适熟烟叶与尚熟烟叶的淀粉含量无显著性差异(P>0.05)。

不同成熟度雪茄烟在晾制过程中的总糖含量结果(图2)显示，晾制0～20 d时，均以尚熟烟叶总糖含量最高，过熟烟叶最低，二者均存在显著性差异(P<0.05)。晾制25 d后，以适熟烟叶总糖含量最高，过熟烟叶最低，二者存在显著性差异(P<0.05)。

不同成熟度雪茄烟在晾制过程中的还原糖含量变化趋势(图2)与总糖含量一致。晾制0～20 d时，均以尚熟烟叶还原糖含量最高，过熟烟叶最低，二者间均存在显著性差异(P<0.05)。晾制25 d后，以适熟烟叶还原糖含量最高，过熟烟叶最低，二者存在显著性差异(P<0.05)。

在整个处理阶段，各成熟度烟叶的淀粉含量在晾制过程中均出现先急剧下降后缓慢减少的过程；适熟烟叶淀粉含量变化幅度最大，淀粉降解速率最快，淀粉降解较完全；过熟烟叶淀粉含量变化幅度较小，淀粉降解速率较慢。各成熟度烟叶的总糖、还原糖含量在晾制过程中均呈现下降趋势。总体上，晾制结束时以适熟烟叶淀粉含量最低，总糖、还原糖含量相对较高。

2.4 晾制过程不同成熟度雪茄烟的淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性变化

不同成熟度雪茄烟在晾制过程中淀粉酶活性结果(图3)显示，晾制0 d时，以过熟烟叶的淀粉酶活性最高，以尚熟烟叶最低，二者存在显著差异(P<0.05)。晾制5 d时，以适熟烟叶的淀粉酶活性最高，以过熟烟叶最低，二者存在显著差异(P<0.05)。晾制10 d时，以适熟烟叶的淀粉酶活性最高，以过熟烟叶最低，三者存在显著差异(P<0.05)。晾制15和20 d时，均以适熟烟叶的淀粉酶活性最高，以过熟烟叶最低；适熟烟叶与尚熟、过熟烟叶的淀粉酶活性存在显著差异(P<0.05)，尚熟烟叶与过熟烟叶的淀粉酶活性无显著差异(P>0.05)。晾制25 d后，以适熟烟叶的淀粉酶活性最高，以过熟烟叶最低，但三个处理无显著差异(P>0.05)。

由图3可知，0 d时，过熟烟叶的淀粉磷酸化酶活性最高，尚熟烟叶的淀粉磷酸化酶活性最低，且二者存在显著差异(P<0.05)。晾制5～15 d时，均以适熟烟叶淀粉磷酸化酶的活性最高，尚熟烟叶活性最低，且三个成熟度烟叶存在显著差异(P<0.05)。晾制20 d时，以适熟烟叶淀粉磷酸化酶的活性最高，尚熟烟叶最低，二者存在显著差异(P<0.05)。晾制25 d后，以适熟烟叶淀粉磷酸化酶的活性最高，尚熟烟叶最低，但三个处理无显著差异(P>0.05)。

在整个试验处理阶段，各成熟度烟叶淀粉酶活性、淀粉磷酸化酶活性在晾制过程中整体呈现先增大后减小的趋势，均在晾制第10 d达到最大值，各处理间存在显著差异。这可能是因为从晾制第11 d开始，烟叶置于晾房上部高温环境下晾制，温度较高影响酶活性，导致酶活性下降。总体上，以适熟烟叶在晾制过程中淀粉酶和淀粉磷酸化酶的活性最高。

图3 不同成熟度雪茄烟晾制过程中淀粉酶和淀粉磷酸化酶活性Fig.3 The activities of amylase and starch phosphorylase during drying in cigar with different maturities

2.5 晾制过程不同成熟度雪茄烟碳水化合物含量与酶活性相关性分析

对晾制过程中雪茄烟的碳水化合物含量与酶活性进行相关性分析。因为三个成熟度雪茄烟叶淀粉酶活性和淀粉磷酸化酶活性均在晾制20 d后差异减小，晾制25 d后，三个成熟度烟叶淀粉酶活性和淀粉磷酸化酶活性无显著差异。因此，仅对0～20 d三个成熟度雪茄烟叶碳水化合物含量与淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性进行相关性分析。结果(表3)显示，不同成熟度雪茄烟淀粉含量与总糖、还原糖含量均呈极显著正相关关系，且均以尚熟烟叶的相关性最高。三个成熟度雪茄烟叶的淀粉含量与淀粉酶活性均呈显著负相关，以适熟烟叶的淀粉含量与淀粉酶活性的相关性最高；淀粉含量与淀粉磷酸化酶活性均呈显著负相关，以适熟烟叶的淀粉含量与淀粉磷酸化酶活性的相关性最高。三个成熟度雪茄烟叶总糖、还原糖含量与淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性均呈负相关关系，但相关性不显著。总体上，以适熟烟叶在晾制过程中的碳水化合物含量与淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性相关性最高，且为显著负相关关系。

2.6 晾制后不同成熟度雪茄烟常规化学成分含量

不同成熟度雪茄烟晾制后常规化学成分结果(表4)显示，总糖以适熟烟叶的含量最高，过熟烟叶的含量最低，二者存在显著性差异。还原糖含量以适熟烟叶的含量最高，过熟烟叶最低，但是三个成熟度烟叶无显著差异。钾以尚熟烟叶的含量最高，过熟烟叶最低，且二者存在显著差异。氯以尚熟烟叶的含量最高，过熟烟叶最低，但三个成熟度烟叶无显著差异。烟碱以过熟烟叶的含量最高，尚熟烟叶最低，且三者存在显著差异。还原糖、氯、总氮的含量在三个成熟度烟叶间均无显著差异。糖碱比以尚熟烟叶最高，过熟烟叶最低，三个成熟度烟叶无显著差异。两糖比和钾氯比均以适熟烟叶最高，过熟烟叶最低，三个成熟度烟叶无显著差异。

可见，总糖、还原糖、两糖比和钾氯比均以适熟烟叶最高。综合来看，以适熟烟叶晾制后的常规化学成分比较协调。

2.7 晾制后不同成熟度雪茄烟内在化学成分综合评价

对不同成熟度雪茄烟的总糖、还原糖、钾、氯、烟碱、总氮和淀粉含量共7项化学指标进行主成分分析，相关矩阵的特征值、贡献率及累计贡献率[19]结果见表5，可见，得到的前两个主成分的累积贡献率达到100%。根据第一主成分与7项化学指标的表达式F1=0.39X1+0.3X2+0.43X3+0.35X4-0.38X5+0.39X6-0.39X7和第二主成分与7项化学指标的表达式F2=0.33X1+0.57X2+0.01X3-0.46X4-0.35X5-0.35X6-0.32X7，以两个主成分所对应的特征值占比提取主成分的总特征值之和的比例作为权重计算主成分综合模型，即可得到主成分综合得分方程F=0.37X1+0.35X2+0.34X3+0.18X4-0.23X5+0.23X6-0.37X7(X1～X7分别代表总糖、还原糖、钾、氯、烟碱、总氮和淀粉含量)。根据主成分计算公式可获得2个主成分与7项化学指标的综合线性方程F=0.38X1+0.37X2+0.32X3+0.15X4-0.2X5+0.2X6-0.37X7(X1～X7分别为代表总糖、还原糖、钾、氯、烟碱、总氮和淀粉含量)，根据方程计算出三个成熟度雪茄烟叶的综合得分及排名(表6)，可见，适熟雪茄烟叶的综合得分最高，其次是尚熟雪茄烟叶，最后是过熟雪茄烟叶。因此，以适熟烟叶晾制后的综合评价最高，化学品质最协调。

表3 不同成熟度雪茄烟碳水化合物含量与酶活性的相关性Table 3 Correlation analysis between carbohydrate contents and its enzyme activities in cigar with different maturities

表4 不同成熟度雪茄烟晾制后常规化学成分含量Table 4 The conventional chemical compositions of cigar during drying with different maturities (%)

表5 主成分分析的特征值及方差贡献率Table 5 Characteristic values and variance contribution rates of principal component analysis

表6 不同成熟度雪茄烟的综合得分Table 6 Total score of cigar with different maturities

3 讨论

在雪茄烟晾制过程中，水分含量对烟叶外观颜色变化有重要影响[20]。烟叶失水过快会造成晾制后的雪茄烟叶颜色浅，呈现青色；失水速度过慢会造成晾制后的雪茄烟叶颜色深，呈现褐色，叶片耐加工性变差[21]；失水速度适中，能促进叶内物质的转换，让烟叶内在化学成分比例协调，促使烟叶品质提升[7]。同时，水分是保持烟叶酶活性的重要前提[22-23]。本研究表明，三个处理烟叶均在10～15 d失水率增加。这是因为从晾制第11 d开始，将烟叶挂于晾房上部即高温低湿环境下晾制造成的。尚熟烟叶在晾制过程中失水速度相对较慢，含水率最高，这可能是因为尚熟雪茄烟叶叶片内蛋白质、含氮化合物等亲水物质较多，导致失水较慢。过熟烟叶在晾制前期水分急剧丧失，失水率较高，这是因为过熟烟叶在采收时叶片已经衰老，叶片内的化学成分在田间已发生较多转化和损失。适熟烟叶在晾制过程中失水速度与含水率均较适中，这与宋洋洋等[24]研究结果一致。

淀粉在烟叶中可作为主要的营养物质，其水解产生的糖类物质也可作为能量物质供有机体利用[25]。已有研究证明，淀粉含量与烟叶成熟度呈正相关关系，淀粉含量高，烟叶成熟度变差；内在化学成分不协调；影响烟叶燃烧速度与燃烧完全性，同时在燃烧时会产生焦糊味，影响感官评价中的香吃味；叶面光滑，易出现杂色，在加工生产中的可用性降低[5]。王瑞新[26]研究证明，糖类物质含量高的烟叶油润光泽，外观质量较好；闫克玉等[27]研究表明，烟叶中还原糖、总糖含量与平衡含水率呈极显著正相关；因此，淀粉含量越低，糖类物质含量越高，其烟叶品质可能越好[28-29]。本研究表明，三个成熟度烟叶淀粉含量在晾制过程中均呈现下降趋势，在晾制前期急剧下降，10 d后趋于平缓。这可能是因为10 d后烟叶挂于高温的晾房上部进行晾制，相关酶活性降低造成的。在晾制10 d后，均呈现过熟烟叶的淀粉含量最高，适熟烟叶的淀粉含量最低，且过熟烟叶淀粉含量与适熟、尚熟烟叶存在显著差异的规律。这可能是因为适熟烟叶的叶片组织结构与内在化学成分已达到调制所需要的最佳状态，因而晾制特性较好，烟叶内淀粉的降解更加充分。在晾制过程中，适熟烟叶淀粉含量变化幅度最大，淀粉降解速率最快[30]。该结论与王传义等[11]研究结果一致。三个成熟度雪茄烟叶总糖、还原糖含量在晾制过程中均呈现下降趋势。在晾制结束时，以适熟烟叶糖类物质含量最高，这是因为在晾制过程中，适熟烟叶的淀粉降解为糖类物质相对较充分，从而使糖类物质含量相对较高。

淀粉酶属于水解酶类，能促进淀粉的水解[31]。淀粉酶活性的高低与作用时长直接影响晾制后烟叶中糖含量的高低和淀粉的残留量，从而影响晾制后雪茄烟的品质[25]。淀粉磷酸化降解是在无机磷酸存在的条件下，在淀粉磷酸化酶的作用下，淀粉降解产生葡萄糖-1-磷酸的过程[31]。本研究表明，三个成熟度雪茄烟的淀粉酶、淀粉磷酸化酶的活性在晾制过程中均呈现先升高后降低的趋势，且均在晾制第10 d达到最大活性。淀粉酶活性在晾制初期，以过熟烟叶的活性最高；在晾制5～20 d，以适熟烟叶的淀粉酶活性最高，过熟烟叶最低；在晾制25 d，三个成熟度淀粉酶的活性无显著差异。淀粉磷酸化酶活性在晾制初期，以过熟烟叶的活性最高；在晾制5～20 d，以适熟烟叶的活性最高，尚熟烟叶活性最低；在晾制25 d，三个成熟度烟叶间无显著性差异。该结论与王怀珠等[30]在烤烟上的研究结果一致。在本研究中，淀粉含量与淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性呈显著负相关关系，这是因为淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性高，有利于淀粉的降解。总糖、还原糖含量与淀粉含量均呈现极显著正相关关系，与淀粉酶、淀粉磷酸化酶的活性均呈负相关关系，这可能是因为雪茄烟晾制周期较长，烟叶在晾制过程中，消耗了大量的糖类物质，淀粉降解生成的糖类物质不足以供应烟叶在晾制过程中消耗的糖类物质；也可能是因为雪茄烟的晾制温湿度条件较温和，该环境条件下微生物较活跃，消耗了烟叶中的部分糖类物质。

烟叶化学成分是烟叶质量的内在表现，直接影响烟叶的感官品质和外观质量。随着烟叶成熟度的提高，其化学成分也随之发生变化。已有研究表明，适当提高钾氯比、氮碱比以及总糖、钾的含量，降低烟碱含量有助于提高烟叶的档次[32]。本研究表明，晾制结束后三个成熟度的雪茄烟叶，适熟烟叶的总糖、还原糖含量以及钾氯比最高；尚熟烟叶的烟碱含量最低，钾含量最高，其燃烧性较好。这可能是因为在晾制过程中适熟烟叶的淀粉含量变化幅度最大，且淀粉降解为糖类物质较彻底，因此晾制结束后其烟叶总糖、还原糖含量最高[33]。已有研究表明，主成分分析综合得分可作为判定化学品质高低的依据[34]。因此，为进一步探究晾制结束后不同成熟度烟叶化学成分的协调性，对其化学成分进行主成分分析，结果表明，适熟烟叶主成分综合得分最高，其次是尚熟烟叶。

综上，雪茄烟适熟时采收，在晾制过程中烟叶失水速度和含水率适中，淀粉含量低、降解速率快、降解较彻底，总糖、还原糖含量较高，淀粉酶和淀粉磷酸化酶活性最高，晾制后烟叶化学品质较好。本研究可为海南省五指山市雪茄烟生产提供理论基础。