无创DNA 联合血清AFP、uE3 及β-HCG 检测在二胎高龄产妇产前筛查唐氏综合征的应用价值

黄晓彬，林佳燕，杨玮莉，吴洁如

（1.揭阳市榕城区妇幼保健计划生育服务中心 检验科，广东 揭阳 522000；2.揭阳市榕城区妇幼保健计划生育服务中心 产前诊断中心，广东 揭阳 522000；3.揭阳市榕城区妇幼保健计划生育服务中心 妇产科，广东 揭阳 522000）

0 引言

唐氏综合征（DS）又称为21-三体综合征，是新生儿中较为常见的染色体异常性疾病，以严重的先天性智力障碍和特殊面容为主要特征，对儿童的学习、生活和生长发育均具有严重的影响[1]。产前诊断是及时发现DS 并预防DS 患儿出生的有效方法。羊膜穿刺后染色体检查结合临床症状是国内外用于DS 诊断的金标准，但对孕妇具有一定的侵入性，且操作复杂，不适合广泛推广。目前在对DS 进行产前筛查中，最常见的是血清学筛查，通过抽取产妇的血清，检测甲胎蛋白（AFP）、游离雌三醇（uE3）和绒毛膜促性腺激素（β-HCG）浓度来对DS 进行筛查试验，但仍存在假阳性率高的特点，无法在实际筛查过程中取得满意的效果。近年来，无创DNA 检测在DS 筛查和诊断中应用逐渐受到关注。无创DNA 检测可通过对产妇外周血中胎儿的DNA 片段进行测序，提高DS 检测的准确性[2]。本次研究通过分析无创DNA 联合血清AFP、uE3 及β-HCG 检测在二胎高龄产妇产前筛查DS 的应用价值，为提高DS 筛查的准确率，减少误诊和漏诊的发生具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年3 月至2020 年3 月在我院进行建卡和常规产检的二胎高龄孕妇180 例为研究对象，年龄35～48 岁，平均（40.75±4.82）岁，孕周15～21 周，平均（18.03±1.72）周。本研究经过我院医学伦理委员会审核批准。

纳入标准：①二次单胎妊娠；②年龄≥35 岁；③1 年之内未接受过异体输血；④4 周之内未接受过引入外源DNA 的免疫治疗、干细胞治疗等；⑤孕产妇染色体正常；⑥孕妇及家属知情同意并自愿参与研究。排除标准：①有DS 家族遗传史；②孕期高血压、糖尿病和慢性心脑血管疾病者；③胎儿超声检查有水囊肿；④严重的心、肝、肾等器质性疾病；⑤吸烟、饮酒等不良生活方式；⑥精神紊乱或意识障碍，不能配合检查；⑦信息资料不全。

1.2 方法

（1）无创DNA 检测。采集5mL 孕妇外周血。4℃1600g 离心10min，分离血浆，再行4℃16000g离心10min 去除残余细胞，抽取血浆3mL，置于离心管内-80℃保存。提取血浆中游离DNA，在血浆游离DNA 片段的两个末端加上接头，构建DNA文库。Illumina 新一代测序技术测序，利用专利的芯片，制备DNA 簇，边合成边测序，自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析，根据公式：某染色体含量（%Chr N）＝某染色体惟一序列读取数／参考序列染色体N 上基因组惟一序列总数；测试样本Chr N 的关联Z-Score=（%Chr N 检测样品-% Chr N 对照组平均值）/S.D.% Chr N 对照组，计算每条染色体的Z-Score值。Z-Score 值≥3 为非整倍体高风险标本，-3＜Z-Score 值＜3 为非整倍体低风险标本。

（2）血清学检测。在规定孕周内采取静脉血2-3mL，3000r/min 离心10min，分离血清置于-20 ℃冰箱，于5 个工作日内检测。采用 DELFIA 时间分辨荧光法及配套的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、游 离 绒 毛膜促性腺游素（free β-human chorionic gonadotropin，free-β-HCG）双标试剂及游离雌三醇（unconjugated estriol，uE3）试剂盒，于1 周内测定孕妇血清标记物 free-β-HCG、uE3、AFP 的生化值。DS 高风险判断标准：DS 和神经管缺陷（NTD）风险≥1:270 为高风险或18－三体综合征（ES）≥1:350 为高风险。

（3）羊膜穿刺后染色体检测。对无创DNA 检测和血清学筛查中任何一种方法判断为DS 高危的孕妇，在其知情同意情况下行羊膜穿刺，进行羊水细胞培养和染色体核型分析，阳性者建议终止妊娠，阴性者继续追踪随访，定期产检复查B 超，直至胎儿出生。

1.3 观察指标

以羊膜穿刺后染色体检测结果为金标准，判断无创DNA、血清学指标以及无创DNA 联合血清学指标筛查DS 的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。

1.4 统计学分析

采用IBM SPSS 25.0 软件进行统计学分析，连续性变量采用（均数±标准差）描述，t检验进行分析；分类变量采用[n（%）]描述，χ2检验进行分析。受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线）分析筛查效能。所有统计以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单一和联合指标筛查二胎高龄孕妇DS效能比较

无创DNA、血清学检测、联合检测筛查二胎高龄孕妇DS 的敏感性分别为87.50%、82.35%和96.15%，三种方法检测敏感度、阳性预测值差异有统计学意义（P ＜0.05），联合检测的敏感度、阳性预测值较单一指标检测高。但三种方法在特异性、阴性预测值上差异无统计学意义（P ＞0.05），见表1。

表1 单一和联合指标筛查二胎高龄孕妇DS效能的比较

2.2 ROC曲线分析三种筛查二胎高龄孕妇DS效能比较

无创DNA、血清学检测、联合检测在筛查二胎高龄孕妇DS 的AUC 分别为0.758、0.733 个0.893。三种方法筛查二胎高龄孕妇DS 的AUC 差异有统计学意义（P ＜0.05），联合检测的AUC 较单一指标检测高，见表2。

表2 ROC曲线分析筛查二胎高龄女性唐氏综合征效能

3 讨论

DS 是临床上最常见的以染色体异常为特征的遗传性疾病，活产儿中发生率约为0.13%-0.17%[3]。患有DS 的患儿60% 在宫内即可发生早期流产，存活下来的患儿多伴有智力低下、生长发育迟缓、特殊面容等，给患儿自身、家庭以及社会均带来严重的负担[4]。因此，对孕妇实施及时有效的产前DS 筛查对预防和减少DS 发生具有重要意义。

高龄产妇是指年龄超过35 岁或受孕时已超过34 岁的孕妇，据研究统计，高龄孕妇DS 患病率明显增加[5]。女性超过35 岁后，生理机能开始下降，此时进行受孕分娩，容易导致异常胎儿和不良妊娠结局的发生。我国母婴保健法中也明确规定，对年龄高于35 岁的孕妇在妊娠中期实施产前诊断从而避免DS 患儿的出生。近年来，二胎政策的开放，使得高龄二胎孕妇人数逐年增加，对高龄二胎孕妇的DS 筛查成为了母婴保健领域的热点问题。

无创DNA 筛查通过采集孕妇静脉血对胎儿游离DNA 进行测序，分析测序结果和染色体信息，筛查DS 发生风险结果准确性更高，多项研究发现无创DNA 筛查DS 的准确率可高达97.3%-100.0%[6]，但在临床实际应用中，由于测序数据分析复杂，受母体血浆DNA 片段波动干扰等影响，也容易造成误诊和漏诊。而血清学筛查具有无创、经济实用和高接受性，逐渐成为DS 筛查的常用检测手段，但仍具有很多的局限，如孕妇的体重、既往不良孕产史等可对检查结果造成一定的干扰，假阳性率较高。因此联合无创DNA 和血清学指标在二胎高龄产妇DS 筛查中应用的意义重大。本次研究中，联合检测的敏感度、阳性预测值较单一指标检测高（P ＜0.05）。联合检测综合两种筛查方法的优点，可降低假阳性率，提高阳性预测值，从而提高DS 筛查的准确性，为优生优育和提高我国人口质量提供助力。

ROC 曲线分析中，无创DNA、血清学检测、联合检测在筛查二胎高龄孕妇DS 的AUC 差异有统计学意义（P ＜0.05），联合检测的AUC 较单一指标检测高，提示无创DNA 联合血清学指标筛查DS 效果更好。在实际应用中，可结合卫生经济学指标合理选择筛查方法，提高对二胎高龄孕妇DS筛查的准确率。

综上所述，无创DNA 联合血清AFP、uE3 及β-HCG 检测可提高二胎高龄产妇唐氏综合征筛查的准确率，降低假阳性率，减少误诊和漏诊的发生，在临床产前筛查中具有重要意义。