牛支原体与附红细胞体混合感染病例的实验室诊断

尹德晶， 陈 静， 杨 鹏， 谢晓东， 李乔斌， 程振涛，2， 王开功，2*， 岳 筠

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

2020年9月12日，贵州省安顺市某养殖场育肥牛出现不明原因的死亡病例，临床症状及病理变化与牛支原体、血液原虫感染相似。为确诊病因，采集相关病料进行实验室检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料采集该养殖场病死牛的肺脏、肝脏、肾脏、心脏、脾脏，以及病牛耳静脉血作为检测病料。

1.2 主要试剂姬姆萨染液(购自上海索莱宝生物科技有限公司)；DNA提取试剂盒、Maker DL 2 000、2×TaqPCR Master Mix(购自TaKaRa公司)；鲜血营养琼脂培养基(自备)。

1.3 主要仪器T20型双槽梯度PCR仪(购自杭州朗基科学仪器有限公司)；Tanon1600全自动数码凝胶成像系统(购自上海天能公司)；HH-2数显恒温水浴锅(购自常州金坛良友仪器有限公司)；OLYMPUS生物显微镜(型号CX33，购自上海普赫光电科技有限公司)。

1.4 临床症状和病理变化观察对养殖场发病情况进行调查，观察病牛临床症状，对病死牛进行剖检观察病理变化。

1.5 牛支原体核酸检测取肺脏组织，加入适量PBS，研磨均匀，离心提取上清。采用DNA试剂盒提取总DNA，针对牛支原体标准株PG45(GenBank登录号：KP229483.1)的TU基因设计1对特异性引物(5’-GCTCAAGCAGGTGACAACGCAG-3’；5’-TCC AACTGTTCTACCACCTTCACGG-3’)，预扩增片段351 bp。PCR扩增体系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 pmol/μL) 各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 血液原虫检查取病牛耳静脉血制成血涂片，经甲醇固定，姬姆萨染色，10×100倍显微镜观察。

1.7 细菌分离培养无菌操作取病死牛的肝脏、肾脏、心脏、脾脏组织，分别接种于鲜血营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h观察结果。

2 结果

2.1 临床症状及病理变化病牛消瘦，被毛粗乱，体温升高至41 ℃，食欲废绝，腹部膨大，站立困难。病理剖检显示肺部炎症和坏死灶。

2.2 牛支原体核酸检测结果检测样品扩增出351 bp 目的条带(见图1)，牛支原体核酸检测结果为阳性，提示存在牛支原体感染。

M：2 000 bp分子质量标准； -：阴性对照； 1：检测样品； +：阳性对照图1 牛支原体PCR检测结果

2.3 血液原虫检查结果血涂片镜检可见大量的红细胞变形为齿轮状、星芒状(见图2)，提示存在附红细胞体感染。未发现其他血液寄生虫感染。

图2 血液原虫检测结果

2.4 细菌分离培养结果接种肝脏、脾脏、心脏、肾脏的鲜血琼脂培养基上未见菌落生长，提示无细菌感染。

3 结论

通过临床症状、病理变化、支原体核酸检测、血液原虫检查和细菌分离培养，确诊病例为牛支原体与附红细胞体混合感染。

4 讨论

4.1牛支原体(Mycoplasmabovis)是1种没有细胞壁的原核生物，感染牛可发生乳腺炎、肺炎、关节炎、角膜结膜炎、中耳炎等，特别是犊牛肺炎和成年母牛乳腺炎[1]。附红细胞体(Eperythrozoon)是1种血液寄生原虫，可附着在红细胞表面或游离于血浆中，没有严格的宿主选择性，可感染人、牛、猪、羊等多种动物；病牛体温升高至40～41.5 ℃，呈稽留热，流清鼻涕，呼吸急促，严重贫血，皮肤及可视黏膜苍白或黄疸，四肢无力，步态不稳，喜卧，少数出现血尿等临床症状[2]。附红细胞体在分类学上曾被归属于立克次氏体，但周作勇等[3]经过基因序列分析比对发现其与支原体的同源性更高，种属关系更为接近。近年来猪、羊、牛支原体和附红细胞体的混合感染均有报道，这2种病原感染前期常呈隐性，不易发现病情，病程缓慢，但混合感染的致病力增强，诊治难度增加，对我国养殖业的危害甚大[4～6]。

4.2牛支原体肺炎多与应激和环境卫生有关，主要通过疫苗接种进行防控。防治附红细胞体病主要通过加强饲养管理、控制和消灭蜱等传播媒介、定期驱虫以减少该病的传播，规模化养殖场应做好定期监测并建立完善的养殖、防疫制度。