猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪附红细胞体混合感染病例的实验室诊断

杨 鹏， 陈 静， 尹德晶， 谢晓东， 李乔斌， 岳 筠， 程振涛*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

近年来，随着我省生猪养殖规模的扩大和流通调运日益频繁，猪病的发生也越来越复杂，特别是猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病等多种病毒性疫病已成为危害养猪业的重要疫病，且常发生多病原混合感染。2020年9月，贵州省兴义市某生猪养殖场出现不明原因死亡病例，通过临床症状观察，怀疑存在多病原混合感染，特采集病料进行实验室病原学检查诊断，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料采集该养猪场3头病死猪的脑、肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、淋巴结及病猪耳静脉血作为检测病料。

1.2 主要试剂姬姆萨染色试剂盒(购自天根生物试剂公司)；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒(CSFV)通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒(PRV)通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、猪圆环病毒2型(PCV2)普通PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨公司)；DNA/RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker 试剂(购自大连宝生物工程有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器T20型双槽梯度PCR仪(购自杭州朗基科学仪器有限公司)；Tanon1600全自动数码凝胶成像系统(购自上海天能公司)；FQD-96A型荧光定量PCR仪(购自杭州博日科技有限公司)。

1.4 血液原虫检查病猪耳静脉血制作血涂片，姬姆萨染色，10×100倍显微镜下观察。

1.5 相关病毒核酸检测取脑、肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、淋巴结组织进行混合匀浆，反复冻融3次，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，取上清液100 μL，用DNA/RNA试剂盒提取总DNA/RNA。以此总DNA/RNA为模板，分别应用PRRSV通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒(判定标准：阳性对照Cq值≤30并出现特异性扩增曲线，阴性对照无Cq值并且无特异性扩增曲线，实验结果成立；被检样品Cq值≤30并出现特异性扩增曲线为PRRSV阳性；被检样品30

2 结果

2.1 血液原虫检查由图1可见：血液样品镜检可见红细胞变形呈齿轮状、星芒状等形态，提示存在附红细胞体感染。未见其他血液寄生虫感染。

图1 3份血涂片检查结果

2.2 PRRSV核酸检测由图2可见：阳性对照Cq值为27，阴性对照无Cq值且无特定扩增曲线。3份检测样品均无Cq值且均未出现扩增曲线，提示组织样品中不存在PRRSV感染。

+：阳性对照； -：阴性对照； 1～3：检测样品图2 PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测结果

2.3 CSFV核酸检测由图3可见：阳性对照Cq值为10，阴性对照无Cq值且无特定扩增曲线。3份检测样品Cq值分别为34、34、32，且有特定扩增曲线，提示组织样品中存在CSFV感染。

+：阳性对照； -：阴性对照； 1～3：检测样品图3 CSFV实时荧光定量RT-PCR检测结果

2.4 PRV核酸检测由图4可见：阳性对照Cq值为29，阴性对照无Cq值且无特定扩增曲线。3份检测样品均无Cq值且均未出现扩增曲线，提示组织样品中不存在PRV感染。

+：阳性对照； -：阴性对照； 1～3：检测样品图4 PRV实时荧光定量RT-PCR检测结果

2.5 PCV2核酸检测由图5可见：3份检测样品PCR均扩增出353 bp目的基因片段，与阳性对照片段相同，提示组织样品中存在PCV2感染。

M：2 000 bp分子质量标准； +：阳性对照； -：阴性对照； 1～3：检测样品图5 PCV2 PCR检测结果

3 结论

通过相关病毒核酸检测和血液原虫检查，确诊猪场病例存在猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪附红细胞体混合感染。

4 讨论

4.1猪瘟病毒和圆环病毒2型均可引起猪群发生严重的原发性感染，并导致感染猪的免疫抑制，引起其他病原的继发或混合感染[1]。近年来关于猪瘟病毒和猪圆环病毒2 型等多病原混合感染的报道较多，给猪场造成严重经济损失[2～5]。目前，关于猪瘟和猪圆环病毒病的防控主要依靠疫苗免疫，科学的免疫程序是预防疫病的关键[6]。疫病的发生通常与猪场的卫生条件差、消毒制度不严格、疫苗免疫失败等有关[7]。

4.2附红细胞体病是由附红细胞体寄生于动物血液、组织液及脑脊液中引起的1种原虫病，猪、牛、羊等动物均可感染[8～10]。近年来猪附红细胞体病已成为猪的常见病和多发病，一年四季均可发生，不同日龄、品种的猪均易感染，且感染率和发病率都很高，并多与其他疫病混合感染，造成诊断和治疗的难度增加[11]。预防本病要做好猪舍的环境卫生，定期驱虫，杀灭蚊、蝇、虱以切断传播途径[12]。