基于网络药理学研究黑豆方主要药物治疗湿疹的作用机制

曲 尧 范 玉 刘绿野 王钰菁 张 洁 耿立东

1.山东中医药大学第一临床医学院，山东济南 250014；2.山东中医药大学附属医院皮肤科，山东济南 250014；3.山东中医药大学中医学院，山东济南 250014

湿疹是由多种内外因素引起的一种具有明显渗出倾向的临床常见的皮肤炎症性疾病，病因目前尚不明确，具有皮疹多型、多对称发生、自觉奇痒、病程缠绵反复的特点，严重影响患者的生活质量。在中医学中湿疹属于湿疮范畴，以清热利湿止痒为主要治法[1]。黑豆方为山东中医药大学附属医院皮肤科临床协定方，在临床治疗中取得了较好效果。本研究选用黑豆方中的6味主要药物：黑豆、马齿苋、地骨皮、黄柏、白鲜皮、白及，基于网络药理学的相关方法，发掘新的疾病相关的潜在治疗靶点，并探索其分子作用机制。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Version2.3）[2-3]，药物靶标数据库（DrugBank，Version5.1.5）；GeneCards（Version 4.13），在线人类孟德尔遗传综合数据库（OMIM）；蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络平台STRING（Version 11.0）；UniProt蛋白质数据库[4]；京都基因和基因组数据库（KEGG，Release 93.0）[5]；R软件（Version 3.6.2）；Cytoscape（Version 3.7.2）。

1.2 获取药物成分的筛选及靶点

通过TCMSP数据库搜索6味中药的中文名称，对口服生物利用度（OB）和类药性（DL）设定数值（OB≥30%，DL≥0.18）作为筛选条件[6]。获得药物的化学成分并通过DrugBank数据库获得各成分信息。

1.3 获取湿疹相关基因及靶点信息

在GeneCards数据库中检索“eczema”，在OMIM数据库中检索“weeping dermatitis”，获得湿疹相关基因。在UniProt蛋白质数据库中检索“Homo sapiens”获得人类蛋白质-基因表达信息。

1.4 筛选交集基因

参照UniProt蛋白质数据库获得的人类蛋白质-基因表达信息，处理数据，得到药物-成分-靶点-基因之间的对应关系，并通过R绘制韦恩图[7]，获得药物与湿疹的交集基因。

1.5 构建药物-成分-靶点-基因网络

将“1.4”中得到的文件导入Cytoscape，构建多维网络[8]，对所得网络进行分析。

1.6 PPI网络构建与分析

将“1.4”中得到的交集基因输入STRING平台，得到PPI网络图，进行网络分析。

1.7 基因本体（GO）功能和KEGG通路富集分析

使用R软件对交集基因进行GO功能[9]和KEGG通路富集分析，获得数据，绘制统计图表，在KEGG数据库中检索，获得通路信息及通路图。

2 结果

2.1 药物成分及其信息、对应靶点、基因、来源

6味药物筛选得到100个药物成分，非重复成分89种[9-15]。潜在靶点基因121个。部分数据见表1～2。

表1 药物成分及信息

2.2 疾病数据

由GeneCards和OMIM数据库得到湿疹相关基因2738个。

表2 药物成分对应靶点、基因、来源

2.3 交集基因与韦恩图

获得交集基因共47个（占药物成分对应基因总数的38.84%，占疾病相关基因总数的1.72%），并绘制韦恩图。见图1。

2.4 构建药物-成分-靶点-基因网络

处理交集基因和药物成分相关数据，获得药物-成分-基因-疾病的多维网络关系，部分节点数据见表3，网络关系见图2。网络分析结果显示白鲜皮、黄柏、马齿苋中的共有成分槲皮素（quercetin）[16-17]是药物成分中对湿疹治疗靶点对应最多（槲皮素对应节点为38个，其中35个为疾病治疗靶点）的成分。

2.5 PPI网络构建与分析

将47个交集基因导入STRING平台，按置信度=0.400为标准生成图像，见图3，得到47个节点，326条连线，节点平均连线数为13.900，局部平均聚集系数为0.649，PPI网络富集P值小于1.0e-16。使用R软件对所得数据进行处理，得到PPI网络图中与交集基因有互作的基因数目，见图4。

图1 疾病与药物交集基因韦恩图

表3 部分节点信息

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

2.6.1 GO功能富集分析 共得到876个GO条目，部分数据见表4。按照P值由小到大生成条形图和气泡图，见图5～6。

2.6.2 KEGG通路富集分析 得到82条相关通路，部分通路数据见表5，按照P值由小到大生成条形图和气泡图，见图7～8。KEGG通路富集分析结果显示黑豆等6味中药的主要成分在治疗湿疹的过程中可能涉及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路（图9）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、肿瘤中的MicroRNA通路。

图2 药物-疾病-成分-基因四维网络图

图3 蛋白质-蛋白质相互作用网络图

图4 蛋白质-蛋白质相互作用基因数目条形图

图5 基因本体功能富集分析条形图

图6 基因本体功能富集分析气泡图

图7 京都基因与基因组百科全书通路富集分析条形图

图8 京都基因与基因组百科全书通路富集分析气泡图

3 讨论

本研究结果显示黄柏、白鲜皮、马齿苋中均存在的槲皮素及黑豆中的豆甾醇（stigmasterol）可能是对湿疹发挥治疗作用的重要成分[18]。其中槲皮素对应的靶点基因达到35个，对应基因多数位于按P值排序后排序较为靠前的通路中。查阅文献发现槲皮素与KEGG通路富集分析中P值最小的TNF信号通路在其他疾病中存在关联[19]。研究显示，槲皮素能改善脂多糖诱导的人肝细胞炎症损伤，减少白细胞介素（interleukin，IL）-1β、TNF-α 等炎症因子释放[20]。槲皮素同时也是鱼腥草的抗菌活性成分[21]。此外，有报道，槲皮素对胃癌、肝癌、鼻咽癌等有抗肿瘤活性[22-23]。

表4 GO功能富集分析结果

表5 KEGG通路富集分析结果

图9 肿瘤坏死因子信号通路图

结合PPI网络分析与KEGG通路富集分析所得数据，黑豆方中主要药物成分作用靶点涉及IL-6和胱天蛋白酶3调控的TNF信号通路。其中IL-6作为介导炎症反应因子的编码基因，在湿疹发病过程中可能起到重要作用[24-25]。彭艳梅[26]在治疗表皮生长因子抑制剂相关皮肤不良反应的临床和实验研究中发现，炎症性致痒皮肤病小鼠组织中白三烯B4、TNF-α、IL-1β的释放增加，且血清中的含量高于皮肤组织，并发现使用止痒平肤液（主要药物为黄芩、苦参、白鲜皮、马齿苋4味）能减少皮肤组织和血清中TNF-α、IL-1β的释放，该研究提示中药复方可通过调整炎症机制，发挥抗感染作用治疗湿疹。

本研究通过网络药理学的相关方法对多个数据库所得数据进行的一系列数据处理、分析[27]。从PPI、GO功能富集、KEGG通路富集三个方面，探寻黑豆方治疗湿疹的潜在靶点蛋白与信号通路，为后续进行相关的动物试验验证提供研究思路和方向，为进一步探究中药复方治疗湿疹的机制提供参考。