基于网络药理学角度探讨银芪软膏对糖尿病足溃疡的干预机制

陈润铭 杜玉青 李友山 董学宇 安 琪 谢存香

北京中医药大学东直门医院周围血管科，北京 100700

糖尿病足溃疡是由糖尿病微血管病变导致的局部溃疡，具有高发和高致残的特点。截止到2019年，我国糖尿病足溃疡的年发病率已经达到8.1%，同时，糖尿病足溃疡是造成非外伤性低位截肢的最主要原因之一[1]。因此控制糖尿病足溃疡恶化以减少截肢的发生是糖尿病足溃疡的治疗重点。

中医药在治疗糖尿病足溃疡上有着丰富的经验和卓越的效果。银芪软膏是由全国名老中医，我国周围血管科专家庞鹤教授在总结自己治疗糖尿病足溃疡多年的临床经验的基础上研制而成的外用制剂，在临床上收效显著。李友山等[2]实验中证实了银芪软膏有明显促进糖尿病足溃疡愈合的作用。《中医药发展战略规划纲要（2016—2030年）》[3]中指出鼓励基于经典名方、名医名方、医疗机构制剂等的中药新药研发。银芪软膏属于名医名方，应该得到开发与应用，这不仅符合国家中医药发展战略地实施，也为糖尿病足溃疡提供新药。然而银芪软膏的有效成分以及作用机制在现阶段尚存疑，这使其质量评价以及进一步开发受到了限制。

银芪软膏由金银花、黄芪、三七组成，具有清热解毒、化瘀生肌的作用。然而其具体生效机制并不是每味中药功效的简单相加，而是诸味药物协同作用于人体而成的结果。找到中药作用于机体生命活动的规律是发现中药作用机制的关键。网络药理学是一门把系统生物学和药理学相结合的新学科，它能够把中药化学成分、化学成分的作用靶点、疾病靶标以及信号通路联系起来，构建“中药-化学成分-靶标-通路”相互作用的网络关系，通过对网络的富集分析，从中发现药物与疾病的关系。这为找到药物的作用机制和开发新药提供了新思路[4]。本研究基于网络药理学构建了银芪软膏与糖尿病足溃疡的“中药-化学成分-核心靶标-通路”的网络，旨在探讨银芪软膏对糖尿病足溃疡的干预机制，为银芪软膏的质量评价及新药开发提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 银芪软膏与糖尿病足溃疡“成分-靶标-通路-疾病”的网络构建

1.1.1 银芪软膏化学成分来源 在中医药整合药理学研究平台2.0（TCMIP v2.0）选择中药材数据库这一模块，在页面分别输入“金银花”“黄芪”“三七”，即可获得这3味中药的化学成分，建立银芪软膏的化学成分数据库。

1.1.2 候选靶标来源及靶标预测 在TCMIP v2.0疾病相关分子数据库，输入“Diabetic Foot Ulcer”作为疾病关键词进行检索，就可以收集到糖尿病足溃疡的候选疾病靶标。选择中药靶标预测及功能分析模块，输入“金银花-黄芪-三七”，选取相似性分数≥0.8的成分预测靶标作为候选。TCMIP v2.0利用Tanimoto系数定义的相似度计量方法，针对中药化学成分（可根据成药性等级进行筛选）与食品药品监督管理局上市药物进行相似性打分，取相似分数≥0.8的中药候选靶标。

1.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）信息 银芪软膏的潜在靶标与糖尿病足溃疡疾病靶标之间的PPI可通过TCMIP v2.0直接获得，该平台整合了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase等多个蛋白质相互作用数据库。

1.1.4 网络构建与分析 通过TCMIP v2.0的中医药关联网络挖掘模块，针对银芪软膏作用的潜在靶标与糖尿病足溃疡疾病靶标之间的PPI信息计算网络特征值，以“节点连接度（degree）”的2倍中位数为卡值，选取中药靶标-疾病基因互作网络的核心节点（hubs）；在此基础上，以“degree”“节点紧密度（closeness）”和“节点介度（betweenness）”的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为银芪软膏治疗糖尿病足溃疡的关键靶标网络。通过基因功能和通路的富集分析，进一步挖掘银芪软膏治疗糖尿病足溃疡的关键靶标及其对应的活性成分，并构建可视化的“中药-化学成分-核心靶标-通路”多层次网络关联图。

1.2 基因功能和通路富集分析

在TCMIP v2.0平台选择中医药关联网络挖掘模块，依托Reactome数据库的Pathway信息，筛选银芪软膏关键网络靶标基因显著参与的分子通路；依托基因本体数据库（GO）筛选银芪软膏关键网络靶标基因显著参与的生物学反应、所行使的分子功能及其所在细胞内定位；通过KEGG富集分析，针对银芪软膏的关键潜在靶标，进行基因功能分析和通路分析，并将P值排名靠前的通路展示在结果中。

2 结果

2.1 银芪软膏化学成分预测及靶标分析

金银花总共收集化学成分47个，预测靶标163个，主要为有机酸类、环烯醚萜类、黄酮类等。黄芪总共收集化学成分27个，预测靶标399个，主要由黄酮类、皂苷类、多糖类等组成。三七总共收集化学成分79个，预测靶标246个，其中主要成分为三七总皂苷。其中金银花与黄芪共有靶标120个，金银花与三七共有靶标136个，黄芪与三七共有靶标217个。

对银芪软膏进行基因分析（表1），可见候选靶标基因功能分析涉及类固醇激素介导的信号通路、离子跨膜运输、脂质代谢过程等条目。对银芪软膏候选靶标进行通路富集分析（表2），可见涉及核受体转录途径、γ-氨基丁酸（GABA）受体激活、二氧化碳的可逆水合作用、白细胞介素-4和白细胞介素-13信号等通路。

2.2 银芪软膏治疗糖尿病足溃疡的核心靶标网络

通过TCMIP v2.0的中医药关联网络挖掘模块，构建银芪软膏潜在靶标与疾病靶标相互作用网络，见图1。根据条件筛选出核心靶标网络12个节点，节点大小与degree呈正相关，其中核心节点有4个，疾病与药物联系最密切的靶标为ABL1。

表1 银芪软膏候选靶标基因功能分析

2.3 银芪软膏治疗糖尿病足溃疡的GO基因功能及KEGG通路富集分析

图1 银芪软膏治疗糖尿病足溃疡核心靶标网络

银芪软膏的GO基因功能分析结果显示有共因子代谢过程、一氧化氮合成活性调节、转录的正调节，DNA模板化、基因表达的负调节、信号转导、RNA聚合酶Ⅱ对转录的正反调节、DNA模板化的9个条目。见表3。银芪软膏的kEGG通路富集分析结果显示其主要作用通路包括四氢生物蝶呤（BH4）的合成、再循环、回收和调节，一氧化氮合成酶（eNOS）激活，血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）介导的血管通透性3个条目。见表4。

表3 银芪软膏治疗糖尿病足溃疡关键靶标基因功能分析

表4 银芪软膏治疗糖尿病足溃疡关键靶标通路富集分析

2.4 银芪软膏治疗糖尿病足溃疡的“中药-成分-靶标-通路”多维网络

银芪软膏的关键药靶一共有4个，靶标大小与相关度呈正相关。见图2。图中最大的靶标为HSP90AA1。该网络还与53个化学成分相关联，其中黄芪4个，分别为β-谷甾醇、华良姜素、黄芪皂苷Ⅶ、4-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷。金银花16个，分别是β-谷甾醇、豆甾醇、胡萝卜苷、常春藤皂甙元、木樨草素、三萜皂苷类、忍冬甙、灰毡毛忍冬皂苷、常春藤皂苷H、新长春皂苷等。三七33个，含有β-谷甾醇、豆甾醇、胡萝卜苷、人参皂苷、三七皂苷、西洋参皂苷等。

图2 银芪软膏的“药物-成分-靶标-通路”图

3 讨论

糖尿病足溃疡创面的处理一直是糖尿病足治疗的难点和重点。在最新的指南里，中医药外治也是创面处理的重要手段之一[1]。银芪软膏是我国周围血管科名老中医庞鹤教授的经验方，非常适用于中医药法关于经典名方的开发。银芪软膏由金银花、黄芪、三七组成。金银花为君药，甘润寒清，清热解毒，为治热毒所致的痈疮疔疖的要药。黄芪为佐药，甘温升补，又能托毒生肌，善治疮疡难溃难腐。三七散瘀止血，消肿定痛，能驱瘀毒。诸药合用，既能清热解毒，又能补虚托毒外出，驱逐瘀毒，起到去腐生肌之功。然而现阶段中药成分复杂，其作用机制难以阐明。

网络药理学融合了中药学、化学、生物基因学、药理学等多学科的大数据，利用计算机科学技术，形成多学科交叉，多层次融合的网络，把原本孤立的中药化学成分与疾病靶标等联系起来，构建了中药多成分与活性之间的关联，为明确中药药效物质及其分子机制和进一步开发名医名方提供了新的手段[5-6]。本研究正是从网络药理学角度出发，探讨银芪软膏干预糖尿病足溃疡的机制。

金银花具有广谱抗菌作用，对糖尿病足溃疡感染的常见细菌如金黄色葡萄球菌等具有抑制作用[7]。研究发现，金银花含有的绿原酸和异绿原酸具有明显的抗菌作用[8]。除此之外，金银花提取物还有改善胰岛素抵抗的作用[9]。黄芪中黄芪总皂苷不仅能抑制细胞炎症反应、保护内皮细胞，而且能降低血糖[10]。黄芪的黄酮类可通过调节核因子NF-κB信号通路抑制炎症反应[11-12]。三七总皂苷可调节趋化因子2（CCL2）诱导的细胞内氧化应激来减轻细胞炎症[13]。高爱社等[14]实验证实三七总皂苷对损伤的内皮细胞具有修复作用。3味中药的作用靶点均有重合，这提示药物的之间存在药效叠加的可能。

银芪软膏与糖尿病足溃疡共有靶标1个，为ABL1，ABL1属于非受体酪氨酸激酶，参与各种细胞过程，包括细胞生长和分裂、成熟和移动。在不同的细胞状况下，它既可以帮助细胞生存，也触发受控细胞凋亡。因此目前对ABL1的研究多在ABL1突变后引起的慢性骨髓性白血病[15]。至于ABL1与糖尿病足溃疡关系鲜有文献记录，有待研究的进一步深入挖掘。

银芪软膏的主要活性成分可针对多个靶点、多条通路起到促进糖尿病足溃疡恢复的作用。其作用可能与BH4的合成、eNOS激活、VEGFR2介导的血管通透性有关。BH4是内皮eNOS活性所必需的辅因子。eNOS产生的一氧化氮（NO）是血管稳态的关键介质，也是维持正常内皮功能的一个关键方面。eNOS的酶活性取决于其辅因子BH4的可用性。当BH4水平足够时，eNOS产生NO；反之，当BH4水平受到限制时，eNOS会发生酶解偶联并生成超氧化物，从而导致血管氧化应激和内皮功能障碍[16]。在高糖状态下，BH4的合成会下降进而导致血管内皮受损。因此，BH4是修复糖尿病造成的内皮受损的治疗靶点[17]。故银芪软膏可能是通过促进BH4的合成，来激发eNOS，实现维持血管内皮功能的正常，进一步促进糖尿病足溃疡愈合。VEGFR2是已知的VEGF家族中血管生成和构造的主要调节者，它能够提高血管通透性，也是参与内皮细胞的增殖、分化及血管的通透性的重要物质[18-19]。血管通透性与血管生成有密切关系，它能调节内皮屏障的开放，活化内皮细胞的功能[20]。

银芪软膏最大的靶标为HSP90AA1，是相关性最强的靶标。而在Reactome信号通路数据库中，HSP90AA1涉及的通路包含BH4的合成、再循环、回收和调节，eNOS激活，VEGFR2介导的血管通透性，恰与银芪软膏治疗糖尿病足溃疡的通路一致，相较之下其他的靶标均不够其全面，可推测其正是关键靶标。但目前关于HSP90AA1的研究都局限在它参与肿瘤细胞的分化、增殖和血管生成[21-22]。至于它是否也参与内皮细胞的血管再生有待深入研究。β-谷甾醇是3味中药的共有的化学成分。有实验表明β-谷甾醇通过促炎性细胞因子和趋化因子的释放减少，抑制STAT1信号通路来抗炎[23-26]。除此之外，它还有降低血糖的作用[27]。

银芪软膏治疗糖尿病足溃疡效果显著，此次对其分子机制及发挥作用的药效物质基础进行研究可以为银芪软膏及其所含中药成分的进一步研究提供依据。但本研究是基于整合药理学平台的预测，具体机制乃至新药开发还需要具体的实验研究支撑。希望能以本研究为基础，在实验研究中得到进一步验证。